葛根素對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用及其保護(hù)機(jī)制的研究(1)

1、    葛根素對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用及其保護(hù)機(jī)制的研究(1)    】 目的 觀察葛根素（Pue）對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用，及其保護(hù)機(jī)制。方法 首先建立大鼠肝硬化動(dòng)物模型，在此模型基礎(chǔ)上建立大鼠全肝缺血再灌注模型，比較用Pue預(yù)處理對(duì)缺血再灌注后，肝組織光鏡下的形態(tài)學(xué)改變；血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和氧化亞氮（NO）、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性，及肝組織中NO、腫瘤壞死因子（TNF-）、MDA含量、SOD活性變化。結(jié)果

2、 Pue預(yù)處理可使大鼠血清NO含量、肝組織NO含量及SOD活性明顯增高；而血清ALT、AST、MDA含量及肝組織TNF-、MDA含量明顯降低；肝組織形態(tài)損傷也有所減輕。結(jié)論 葛根素對(duì)肝硬化大鼠肝缺血再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用，其主機(jī)制是減少NO的降低、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)；清除氧自由基、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化。        【關(guān)鍵詞】 葛根素；藥物預(yù)處理；缺血再灌注損傷；肝硬化；大鼠        現(xiàn)代肝膽外科中避免術(shù)中過(guò)多的出血，及時(shí)而有效

3、地控制出血是手術(shù)成功的關(guān)鍵之一，阻斷肝血流技術(shù)在肝切除術(shù)中被廣泛應(yīng)用。許多肝臟疾病患者往往伴有肝硬化，其硬化肝臟對(duì)缺血的耐受性較差，長(zhǎng)時(shí)間阻斷入肝血流或術(shù)中大出血均可引起I/R損傷而加重處于代償邊緣的肝臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致術(shù)后發(fā)生肝功能衰竭的可能性增大。因此尋找一種對(duì)肝硬化肝臟缺血及再灌注具有保護(hù)作用的藥物及方法具有重臨床意義。以往采用的缺血預(yù)處理的方法有其缺陷并在臨床應(yīng)用中受到限制，故尋找一種藥物預(yù)處理來(lái)保護(hù)肝組織、減輕I/R損傷具有重的臨床價(jià)值。以往試驗(yàn)證明葛根素對(duì)正常肝臟及其他多個(gè)組織器官的I/R損傷具有良好的保護(hù)作用。本次試驗(yàn)通過(guò)葛根素預(yù)處理及缺血預(yù)處理對(duì)肝硬化大鼠肝臟I/R損傷保護(hù)作用的對(duì)比

4、，探討葛根素是否對(duì)肝硬化大鼠肝臟的I/R損傷具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。    1 材料與方法         動(dòng)物 Wastar大鼠200只，體重200220g，雌雄各半。         儀器與試劑 奧林巴斯2700全自動(dòng)生化分析儀、DY89-1全自動(dòng)玻璃勻漿機(jī)、Arthos HT酶標(biāo)儀、SANYO MDF-330型-70低溫冰箱、HH21-600型恒溫水浴箱、722分光光度計(jì)。CC

5、l4，瀘州市鑫達(dá)化工有限公司提供，批號(hào)20050713；食用酒，瀘州市食品廠提供；葛根素注射液哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)050102B；SOD測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，批號(hào)20050716；MDA測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；TBA法測(cè)定，批號(hào)20050716；NO測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，亞硝酸鹽法測(cè)定，批號(hào)20050719；TNF-測(cè)定試劑盒，上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定，批號(hào)20050719。     模型制備及試驗(yàn)方法   

6、;      大鼠肝硬化模型制備 經(jīng)大鼠腹部皮下注射CCl4大豆油溶液，前4次劑量為0.5ml/100g體重60% CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，第4次后間隔7天注射第5次（可減少大鼠死亡率），第5次起劑量改為0.3ml/100g體重40% CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，共13次；除注射CCl4當(dāng)日外，每日1次60%食用酒灌胃，乙醇劑量0.4g/100g體重；給予正常飲水；以高脂低蛋白飼料喂養(yǎng)。上述操作第6周末停止，繼續(xù)觀察至8周末大鼠肝硬化模型制備成功并趨于穩(wěn)定。第2周起每周末行B超定位肝穿刺病理檢查，8周末挑選肝硬化程度趨于同一水平

7、大鼠128只，繼續(xù)進(jìn)行下面試驗(yàn)。     動(dòng)物分組 按隨機(jī)數(shù)字表法，將128只大鼠隨機(jī)分為4組，每組再分為4個(gè)時(shí)間亞組，每亞組8只大鼠。4組分別為A組：假手術(shù)組；B組：?jiǎn)渭內(nèi)毖俟嘧⒔M；C組：缺血預(yù)處理組；D組：葛根素預(yù)處理組。4個(gè)時(shí)間亞組分別為a亞組：缺血前時(shí)間亞組；b亞組：缺血再灌注后1h時(shí)間亞組；c亞組：缺血再灌注2h時(shí)間亞組；d亞組：缺血再灌注6h時(shí)間亞組。     缺血再灌注模型的制備 術(shù)前禁食12h，自由飲水。以戊巴比妥鈉3mg/100g體重腹腔注射麻醉后開(kāi)腹并充分顯露肝門，游離門靜脈及肝固有動(dòng)脈，用無(wú)

8、損傷動(dòng)脈鉗給予鉗夾，30min后移去動(dòng)脈鉗復(fù)灌60min，形成全肝I/R模型。C組于缺血前反復(fù)3次缺血5min再灌注5min形成缺血預(yù)處理模型及術(shù)前D組12h、1h分別2次分別給予Pue 10mg/100g體重，其他各組給予等量生理鹽水，再行缺血30min，再灌注60min，D組形成葛根素預(yù)處理模型。         標(biāo)本采集 B、C、D組動(dòng)物在再灌注0h（即缺血前）、再灌注1h、2h、6h后分別從各時(shí)間亞組大鼠心內(nèi)取血5.0ml，不加抗凝劑靜置2h，并標(biāo)明分組及動(dòng)物編號(hào)，用自動(dòng)平衡離心機(jī)離心，取部分血清測(cè)定ALT

9、、AST的含量，其余的置入-70冰箱內(nèi)待測(cè)定NO、SOD、MDA。取血后快速取右肝組織進(jìn)行HE染色光鏡觀察；其他肝組織取0.5g制備10%組織勻漿，檢測(cè)其中NO、SOD、MDA及TNF-。A組亦在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取血及肝組織行上述檢查。在實(shí)驗(yàn)完畢時(shí)處死動(dòng)物。    2 結(jié)果     病理結(jié)果 各組低倍鏡下均可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉重建，可見(jiàn)纖維再分隔現(xiàn)象，肝內(nèi)假小葉廣泛形成，同時(shí)伴有明顯的肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生等肝硬化病理表現(xiàn)。A組：除上述表現(xiàn)外未見(jiàn)其他異常。B組：高倍鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞核邊聚、濃縮及溶解，胞漿疏松化，并可見(jiàn)

10、嗜酸性浸潤(rùn)；肝竇明顯狹窄，可見(jiàn)大量的紅細(xì)胞淤積其內(nèi)并有微血栓形成、中性粒細(xì)胞貼壁等。C組：高倍鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞核邊聚、濃縮及溶解，胞漿疏松化，但較B組顯著減輕；肝竇狹窄較輕，但仍有紅細(xì)胞淤積及微血栓形成現(xiàn)象，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。D組：高倍鏡下僅偶見(jiàn)核邊聚，胞漿疏松化；肝竇無(wú)明顯狹窄，內(nèi)無(wú)明顯紅細(xì)胞淤積，及其微血栓形成等，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。     血清及肝臟組織勻漿檢驗(yàn)結(jié)果     各組大鼠肝功酶學(xué)指標(biāo)變化 D組肝功酶學(xué)檢驗(yàn)缺血前與其他各組無(wú)明顯差異（P0.05），再灌注后各時(shí)間點(diǎn)明顯降低B組（P<0.0

11、5），與C組無(wú)顯著差異（P0.05），C、D組再灌注6h時(shí)較B組ALT、AST顯著降低（P<0.05），但與A組相比未完全恢復(fù)正常（            孫 鵬，李五生，張 楠，周小娜，劉金龍【摘】目的觀察葛根素（Pue）對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者

12、抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。P<0.05），見(jiàn)表1。        表1 4組大鼠灌注后各時(shí)間點(diǎn)血清ALT、AST的變化 （x±s，u/L）        注：與A組同時(shí)間點(diǎn)相比，P<0.05；與同組灌注缺血前即0h時(shí)相比，P<0.05；與B組同時(shí)間點(diǎn)相比，*P<0.05     各組大鼠血清NO含量變化 C、D組血

13、清NO與再灌注1h、2h含量較缺血前有所降低，但較B組下降幅度?。≒<0.05）。再灌注6h時(shí)C、D組恢復(fù)正常與A組差異無(wú)顯著性（P0.05）；而B(niǎo)組含量明顯升高，且高于A組（P<0.05），見(jiàn)表2。    表2 4組大鼠灌注后各時(shí)間點(diǎn)血清NO的變化 （x±s，mol/L）        注：與A組同時(shí)間點(diǎn)相比，P<0.05，與同組灌注缺血前即0h時(shí)相比，P<0.05，與B組同時(shí)間點(diǎn)相比，*P 各組大鼠血清SOD活性及MDA的含量變化 D組S

14、OD活性與C組各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異（P0.05），明顯高于B組（P<0.01），再灌注1h時(shí)較A組降低（P<0.05），灌注后6h時(shí)與假手術(shù)組差異無(wú)顯著性（P0.05）。血清MDA含量，缺血再灌注1h、2h時(shí)C、D組較A組有所增高，但增高程度明顯低于B組（P<0.05），再灌注6h時(shí)，D組與A組比較差異無(wú)顯著性（P0.05）。各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的血清SOD、MDA含量變化見(jiàn)表3。        表3 4組大鼠灌注后各時(shí)間點(diǎn)血清SOD、MDA的變化 （x±s）   

15、;     注：與A組同時(shí)間點(diǎn)相比，P<0.05；與同組灌注缺血前即0h時(shí)相比，P<0.05；與B組同時(shí)間點(diǎn)相比，*P     各組大鼠缺血再灌注后1h時(shí)肝臟中NO、MDA、TNF-含量及SOD活性差異 肝臟組織總的NO、MDA、TNF-含量及SOD活性與同時(shí)間點(diǎn)的血清中的各指標(biāo)的趨勢(shì)一致，即C、D組的NO含量及SOD活性顯著高于B組（P<0.05），但較A組稍低（P<0.05），MDA及TNF-含量C、D組顯著低于B組（P<0.05），但較A組稍高（P<0.05），見(jiàn)

16、表4。    表4 4組大鼠灌注后1h肝臟組織勻漿內(nèi)NO、MDA、TNF-含量及SOD活性差異        注：與A組同時(shí)間點(diǎn)相比，P<0.05；與B組同時(shí)間點(diǎn)相比，*P    3 討論     尋找對(duì)肝硬化肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用藥物的理由 現(xiàn)代肝膽外科中避免術(shù)中過(guò)多的出血、及時(shí)而有效地控制出血是手術(shù)成功的關(guān)鍵之一，阻斷肝血流技術(shù)在肝臟切除術(shù)中被廣泛應(yīng)用1。嚴(yán)重肝臟疾病（如肝癌等）

17、患者往往伴有肝硬化，其肝臟對(duì)缺血的耐受性較差2，長(zhǎng)時(shí)間阻斷入肝血流或術(shù)中大出血均可引起I/R損傷而加重處于代償邊緣的肝臟負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致術(shù)后發(fā)生肝功能衰竭的可能性增大。因此尋找一種對(duì)肝硬化肝臟缺血及再灌注具有保護(hù)作用的藥物及方法具有重臨床意義。以往采用的缺血預(yù)處理的方法有其缺陷并在臨床應(yīng)用中受到限制，故尋找一種藥物預(yù)處理來(lái)保護(hù)肝組織、減輕I/R損傷具有重的臨床價(jià)值。     葛根素對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注的保護(hù)作用及機(jī)制 Pue進(jìn)入體內(nèi)后主分布于血漿、腎、肝和心。已有研究證實(shí)其在心、腦、腎等組織的I/R損傷中保護(hù)作用，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)它具有改善微循環(huán)、抗氧化、

18、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能、抑制血小板聚集、降低血液黏度和抗腫瘤等多種作用，雖然以往報(bào)道長(zhǎng)期（78天）應(yīng)用葛根素可致少數(shù)患者轉(zhuǎn)氨酶升高，但未見(jiàn)短期應(yīng)用出現(xiàn)肝損害的報(bào)道，且已有相關(guān)報(bào)道3證實(shí)葛根素對(duì)正常肝臟的缺血再灌注損傷具有良好的保護(hù)作用。        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：光鏡下，與對(duì)照組相比Pue預(yù)處理組，肝細(xì)胞水腫及肝竇狹窄明顯減輕，內(nèi)無(wú)紅細(xì)胞淤積及微血栓形成等，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。血液中ALT、AST及肝組織中TNF-等反映肝損害的指標(biāo)較對(duì)照組顯著減少，表明Pue對(duì)肝硬化大鼠肝臟有明確的保護(hù)作用。 

19、60;      本次實(shí)驗(yàn)所證明主保護(hù)機(jī)制可能是：（1）調(diào)節(jié)NO的含量、改善微循環(huán)：NO是由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等合成并釋放的，由酶P450家族的NO合酶（NOS）產(chǎn)生，NOS作用于L-精氨酸和氧，產(chǎn)生L-谷氨酸和NO。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種NOS的亞型，即神經(jīng)元型NOS（nNOS）、內(nèi)皮型NOS（eNOS）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS）4。這3種亞型在肝臟中都有表達(dá)5，nNOS和eNOS在肝臟中不同細(xì)胞選擇性的表達(dá)，前者只在神經(jīng)組織中可檢測(cè)到，后者只在肝臟血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)受到一定的刺激，iNOS在肝臟組織中廣泛表達(dá)，

20、尤以庫(kù)普弗細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中有大量iNOS表達(dá)。NO量的多少是其加重或是減輕缺血再灌注損傷的重因素，eNOS亞型產(chǎn)生的低水平的NO能夠抵抗移植物成活后再灌注產(chǎn)生的微循環(huán)損傷；而由于iNOS的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)需時(shí)間較長(zhǎng)，幾小時(shí)后才大量的iNOS生成，較多的NO在生成，最終導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧脂物產(chǎn)生、細(xì)胞死亡和肝臟損傷。Pue可在缺血再灌注早期維持肝組織及血清內(nèi)NO含量使之不會(huì)過(guò)多降低，改善缺血再灌注后肝組織微循環(huán)，減輕再灌注后的無(wú)復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生，對(duì)肝臟組織進(jìn)行保護(hù)。（2）抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用：SOD是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重的作用，可清除氧自由基及保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基損

21、傷的作用6。缺血再灌注損傷時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基，氧化生物膜的不飽和脂肪酸，使生物膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能障礙，造成缺血再灌注損傷。同時(shí)形成大量分解產(chǎn)物MDA。MDA含量多少在一定程度上反映了氧自由基對(duì)組織、細(xì)胞損傷的程度。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)SOD與MDA的聯(lián)合檢測(cè)表明：應(yīng)用葛根素組缺血再灌注后SOD活性較對(duì)照組顯著升高（P<0.05），而MDA含量明顯低于對(duì)照組（P<0.05），提示葛根素可通過(guò)增加SOD活性，清除過(guò)多的氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等作用來(lái)達(dá)到保護(hù)缺血再灌注肝臟的目的。       &#

22、160;總之，缺血再灌注損傷是由多種因素引起的，并非單一因素所致。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Pue可通過(guò)調(diào)節(jié)NO含量、改善微循環(huán)、清除自由基等途徑對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷產(chǎn)生較好的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中D組短期使用Pue，缺血前轉(zhuǎn)氨酶較其他組差異無(wú)顯著性（            孫 鵬，李五生，張 楠，周小娜，劉金龍【摘】目的觀察葛根素（Pue）對(duì)肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。P0.05），且全過(guò)程中無(wú)一只大鼠出現(xiàn)出血傾向，可證明短期應(yīng)用Pue不會(huì)增加肝臟功能的損害