鍺132對(duì)體外培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用觀察

1、鍺132對(duì)體外培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用觀察【摘要】目的觀察鍺132對(duì)體外培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的抗增殖作用，尋找輔助治療翼狀胬肉和預(yù)防翼狀胬肉復(fù)發(fā)的新方法。方法將翼狀胬肉成纖維細(xì)胞行體外原代和傳代培養(yǎng)；觀察不同濃度鍺132及絲裂霉素C對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響及對(duì)培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖抑制作用和毒性作用；采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的表達(dá)。結(jié)果鍺132可抑制體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞對(duì)PCNA的表達(dá)，使其生長(zhǎng)曲線顯著下移；對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性，且無(wú)細(xì)胞毒性

2、反應(yīng)。結(jié)論鍺132可有效抑制翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的增殖活性?！娟P(guān)鍵詞】鍺132；翼狀胬肉；成纖維細(xì)胞；組織培養(yǎng)An observation of antiproliferative effect of germanium-132 on cultured pterygium fibroblastsLIU Yang, SUN Xianli, LI Bin, et al.Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing 100005, China【Abstract】ObjectiveTo detect the antiproliferation of carbox

3、yethyl germanium sesquioxide (Ge-132) on fibroblasts of pterygium in vitro and try to find a potentially effective agent for treatment of primary pterygium and prevention of its postoperative recurrence. MethodsPrimary culture and subculture of pterygium fibroblasts were established in vitro. Differ

4、ent concentrations of Ge-132 (395 000 mg/L) or mitomycin-C (3.134.00 mg/L, the control) were added to the fibroblast culture of the third or forth passage respectively. The inhibitory effect was determined by MTT (tetrazolium bromide) method. The influence of addition of Ge-132 on the growth curve o

5、f fibroblasts was observed, and the changing expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in fibroblasts was studied by immunohistochemical method. ResultsThe addition of Ge-132 in the culture caused significant inhibition of the fibroblast proliferation in dose dependent manner (62550 00

6、0 mg/L) without cytotoxicity (IC50=3 000 mg/L), the marked descent of growth curve and suppression of the expression of PCNA in cultured cells (P0.01). ConclusionGe-132 can inhibit the proliferation of pterygium fibroblast in vitro significantly.【Key words】Ge-132；Pterygium；Fibroblast；Tissue culture治

7、療翼狀胬肉的手術(shù)方法較多，但均不能有效地降低其復(fù)發(fā)率。目前常采用的一些輔助療法，如用氬激光、準(zhǔn)分子激光、放射線及免疫抑制劑（5-氟尿嘧啶、絲裂霉素C）等方法試降低翼狀胬肉術(shù)后的復(fù)發(fā)率，未見明顯療效，但有增加并發(fā)癥的可能，因此尋找有效、副作用少的治療方法是許多學(xué)者所面臨的研究課題。近年來，許多研究結(jié)果證實(shí)1，2，鍺132（carboxyethyl germanium sesquioxide,羧乙基鍺倍半氧化物）是一種具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗病毒等廣泛藥理作用的化合物。淺井一彥首先發(fā)現(xiàn)人參、枸杞及猢猻眼等中藥中均富含鍺132；1976年Tsutsui等1證實(shí)，鍺132的化學(xué)結(jié)構(gòu)為，同年首次人

8、工合成鍺132，并在一些動(dòng)物移植性瘤株中證實(shí)其具有較強(qiáng)的抑瘤效應(yīng)。但是，對(duì)鍺132的抗腫瘤、抗增殖作用的研究，目前僅限于全身給藥途徑的實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察，對(duì)眼局部抗增殖作用的研究尚未見報(bào)道。為此筆者應(yīng)用不同濃度鍺132對(duì)體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞抗增殖作用進(jìn)行觀察，尋找治療翼狀胬肉的新方法，同時(shí)探討其作用機(jī)制。材料與方法一、翼狀胬肉成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定1.原代培養(yǎng)：翼狀胬肉組織標(biāo)本由首都醫(yī)科大學(xué)附屬同仁醫(yī)院眼科門診手術(shù)室提供。細(xì)胞培養(yǎng)參照Chen等3的方法。DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Sigma公司），內(nèi)含20%小牛血清（北京紅星生物制品公司）及10 mg/L慶大霉素。原代接種3 d后觀察組織塊

9、貼壁情況、培養(yǎng)液色澤以及是否有微生物污染。然后均于每3或4 d更換1次培養(yǎng)液，并每天在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)特征。2.傳代培養(yǎng)：待成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，以0.25%的胰蛋白酶（美國(guó)Difco公司）作用細(xì)胞約5min，再加入適量培養(yǎng)液并用吸管吹打瓶壁使細(xì)胞懸起、分散，以血球計(jì)數(shù)板（上海市滬江醫(yī)療器材經(jīng)營(yíng)部）計(jì)數(shù)細(xì)胞，并按12或13分種細(xì)胞，每3或4 d更換1次培養(yǎng)液。3.翼狀胬肉成纖維細(xì)胞鑒定：以兔抗人波形蛋白單克隆抗體、細(xì)胞角蛋白單克隆抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司）經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素（SP）法行免疫組織化學(xué)染色，3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，并結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)特

10、性及形態(tài)學(xué)特征，確認(rèn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。二、鍺132對(duì)培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞抗增殖作用觀察1.觀察鍺132作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：在傳代至第3或4代的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞 （貼壁24 h后）中加入鍺132（廣州軍區(qū)藥檢所提供），并以絲裂霉素C（mitomycin-C，MMC）為對(duì)照，使其終濃度分別為2 500 mg/L及25 mg/L，培養(yǎng)24、48及72 h后在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞分布及形態(tài)學(xué)變化。2.增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的檢測(cè)：將細(xì)胞懸液接種于鋪有蓋玻片（按細(xì)胞培養(yǎng)用品清洗和高壓滅菌）的6孔板中，孵育24 h后

11、分為A、B兩組，A組為對(duì)照組，B組為鍺132組（終濃度為2 500 mg/L），孵育24 h后取出蓋玻片，經(jīng)免疫組織化學(xué)SP法染色（同前）檢測(cè)PCNA（鼠抗人PCNA單抗，Santa Cruz公司）的表達(dá)。結(jié)果分析采用比較PCNA標(biāo)記指數(shù)（labelling index, LI），即平均每100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)6個(gè)視野（放大倍率2010）的全部陽(yáng)性細(xì)胞及陰性細(xì)胞并列表，將計(jì)數(shù)資料進(jìn)行2檢驗(yàn)。3.對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用檢測(cè)：四甲基偶氮唑鹽法（tetrazolium bromide，MTT)。向平底96孔板內(nèi)加入5104/ml的細(xì)胞懸液100l/孔；待細(xì)胞貼壁24 h后，分別加入不同

12、濃度的鍺132（39、78、156、313、625、1 250、2 500及5 000 mg/L）、MMC（3.13、6.25、12.5、25 、50、100、200及400 mg/L），每種藥物按不同濃度分別設(shè)3個(gè)平行孔（并設(shè)無(wú)藥物空白對(duì)照孔）；然后置37、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)48 h；每孔加入濃度為5 000 mg/L 的四甲基偶氮唑鹽溶液20 l，置培養(yǎng)箱內(nèi)過夜；每孔加入20%十二烷基磺酸鈉 (sodium dodecyl sulphate，SDS)-50%二甲基甲酰胺（N,N-dimethyl formamide，DMF）100 l，室溫下靜置6 h；于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)

13、Bio RAD450）上測(cè)定各孔吸光度(A)值（最大吸收波長(zhǎng)為600 nm）。將此實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率%=（1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值）100%，并繪制抑制率曲線4。4.成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制：調(diào)整細(xì)胞濃度為4104/ml，取可拆卸96孔板，將每條板的各個(gè)孔（共16個(gè)孔）內(nèi)接種100 l上述細(xì)胞懸液，并將每板平均分為A、B兩組（每組8孔），A組為對(duì)照組，B組為鍺132組（終濃度為1 000 mg/L），每日取出其中1條，按實(shí)驗(yàn)方法3進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果一、培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性1.培養(yǎng)細(xì)胞的鏡下形態(tài)：翼狀胬肉組織塊接種24 h后即可見細(xì)胞由組織塊中游離出，并逐漸

14、形成生長(zhǎng)暈，在1或2周時(shí)為排列緊密的單層圓形或多邊形類上皮細(xì)胞，核分裂像多見，胞核較小、圓形，位于細(xì)胞中央。相鄰細(xì)胞間連接緊密，相互銜接成片（1）。僅見少量散在的成纖維細(xì)胞由組織塊向四周呈放射狀游離出，且這些細(xì)胞多貼附于上皮細(xì)胞表面。成纖維細(xì)胞為長(zhǎng)梭形、三角形、扇形或不規(guī)則形態(tài)，體積大、小不一，胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央（2）。培養(yǎng)至2周后，成纖維細(xì)胞逐漸增多，與上皮細(xì)胞分界清晰，呈瀑布狀、放射狀及螺旋狀或編織狀排列，至匯合時(shí)，細(xì)胞排列密集，細(xì)胞界限不清，部分胞體交叉重疊，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其增殖活性增強(qiáng)；而上皮細(xì)胞輪廓清晰，胞漿內(nèi)顆粒增多，趨于老化、脫落，消失。1原代培養(yǎng)翼狀胬肉上皮細(xì)胞，細(xì)

15、胞緊密連接，相互銜接成片相差顯微鏡402原代培養(yǎng)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞，示細(xì)胞形態(tài)及排列方式相差顯微鏡402.兩種原代貼壁細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性：在0.25%胰蛋白酶作用下，5 min后即可見成纖維細(xì)胞收縮、變圓、易于被吹打下來；而上皮細(xì)胞則在短時(shí)間內(nèi)很難被胰蛋白酶消化，個(gè)別被消化和吹打下來的細(xì)胞，大多不收縮變圓而呈片狀；在再次貼壁過程中，成纖維細(xì)胞可在20 min內(nèi)全部貼壁，隨后逐漸附壁、延展及極性化，而上皮細(xì)胞則極少再貼壁。二、成纖維細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞經(jīng)SP法染色可見波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性（3），陽(yáng)性表達(dá)位于胞漿，呈現(xiàn)與成纖維細(xì)胞長(zhǎng)軸方向一致棕黃色束狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；細(xì)胞角

16、蛋白表達(dá)陰性（4）。3翼狀胬肉成纖維細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性免疫組化染色SP2004翼狀胬肉成纖維細(xì)胞角蛋白表達(dá)陰性免疫組化染色SP100三、鍺132對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的影響1.鍺132組：藥物作用24 h后無(wú)顯著變化；48 h后大部分細(xì)胞收縮、但未變圓及脫壁；72 h后，幾乎全部細(xì)胞變圓，部分脫壁，無(wú)細(xì)胞碎裂、崩解，細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯減少（5）。5鍺132作用翼狀胬肉成纖維細(xì)胞72 h后，示細(xì)胞變圓、脫壁，無(wú)細(xì)胞碎裂、崩解相差顯微鏡402.MMC組：早期細(xì)胞形態(tài)正常，隨時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞可出現(xiàn)毒性反應(yīng)，可見細(xì)胞碎裂、崩解，細(xì)胞數(shù)逐漸減少至無(wú)活性細(xì)胞，僅見少量貼壁無(wú)活性細(xì)胞（6）。6絲裂霉素C作用翼狀胬肉

17、成纖維細(xì)胞72 h后，示細(xì)胞碎裂、崩解，且細(xì)胞數(shù)漸減少相差顯微鏡40四、兩組PCNA染色表達(dá)比較細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)顯示為棕黃色、黃色或淺黃色細(xì)小均勻顆粒，分布于整個(gè)細(xì)胞核；細(xì)胞核無(wú)著色、胞漿呈淡黃色者為陰性。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)經(jīng)四格表2檢驗(yàn)差異有非常顯著性（2=42.15，P0.01）。鍺132組和對(duì)照組PCNA標(biāo)記指數(shù)分別為38.3%及70.6%，說明鍺132對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞PCNA的表達(dá)有明顯影響（表1）（7，8）。表1鍺132組與對(duì)照組PCNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)比較組別PCNA表達(dá)細(xì)胞數(shù)標(biāo)記指數(shù)(%)2值P值(-)(+)鍺132組12175對(duì)照組601447加入鍺132后PCNA表達(dá)情況免疫組化染

18、色SP1008對(duì)照組PCNA表達(dá)情況免疫組化染色SP100五、不同濃度鍺132及MMC對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的增殖抑制作用兩組藥物隨濃度增加，其抑制作用增強(qiáng)，并呈劑量依賴性。而鍺132組不同濃度的抑制率均低于MMC組，尤其是當(dāng)藥物濃度低時(shí)，即625mg/L時(shí)，其抑制作用增強(qiáng)且較快。半數(shù)抑制濃度（IC50）約為3 000 mg/L。六、鍺132對(duì)體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響（9）9鍺132（1 000 mg/L）對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響從中可見，對(duì)照組曲線可明顯區(qū)分為指數(shù)增長(zhǎng)期（接種后2496 h）和平臺(tái)期（96 h以后），而用藥組曲線則下移，上升緩慢，趨于低平，無(wú)明顯的指

19、數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期，在用藥72 h吸光度達(dá)峰值，以后逐漸下降。討論一、細(xì)胞純化及細(xì)胞鑒定方法的選擇本實(shí)驗(yàn)通過傳代時(shí)兩種細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同、再次貼壁難易差別及細(xì)胞不同時(shí)期增殖活性的差異，進(jìn)行2或3次細(xì)胞傳代，即可獲得純化成纖維細(xì)胞。進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。5種細(xì)胞骨架中間絲蛋白的表達(dá)具有組織特異性5，如上皮來源的組織細(xì)胞常用細(xì)胞角蛋白作標(biāo)記，而中胚葉或間質(zhì)來源的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞則可用波形蛋白作標(biāo)記6,7。本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞對(duì)波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性，角蛋白表達(dá)陰性；結(jié)合組織來源，細(xì)胞生長(zhǎng)特性可以確認(rèn)為成纖維細(xì)胞。我們所采用的體外細(xì)胞培養(yǎng)方法成熟可靠，可為進(jìn)一步研究翼狀胬肉增

20、殖機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料，并為探索增殖性眼病的藥物、治療方法奠定基礎(chǔ)。二、鍺132的抗增殖作用筆者采用鍺132對(duì)培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的抗增殖作用進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)鍺132可抑制細(xì)胞過度增殖，而不造成細(xì)胞毒性反應(yīng)。如在手術(shù)治療同時(shí)應(yīng)用，可提高手術(shù)成功率。目前，國(guó)內(nèi)外臨床應(yīng)用較多的為MMC，它可有效抑制成纖維細(xì)胞的增殖，防止活化增殖的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，主要是膠原的沉積。但難以避免輕度淺層點(diǎn)狀角膜炎、角膜水腫、角膜穿孔、鞏膜軟化，鞏膜潰瘍和壞死、虹膜炎、突發(fā)性白內(nèi)障及繼發(fā)性青光眼等并發(fā)癥8-10。本文亦觀察到MMC對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性作用，而鍺132的抗增殖作用則較為緩和。鍺132的抗癌及抗增

21、殖機(jī)制尚未完全闡明，目前研究結(jié)果顯示可能與下列因素有關(guān)1，2：（1）降低癌細(xì)胞的生物電位，癌細(xì)胞的生物電位較正常細(xì)胞高，易于裂殖變化。有機(jī)鍺化合物的鍺其外層電子為4S2、4P2，可產(chǎn)生電荷轉(zhuǎn)移和游離基，自由電子可以從高電位癌細(xì)胞奪取氫，因而降低癌細(xì)胞電位，阻止癌細(xì)胞繁殖。（2）增強(qiáng)免疫功能，已經(jīng)證明鍺132是一種新的干擾素誘導(dǎo)劑，能在體內(nèi)誘導(dǎo)人或小鼠產(chǎn)生-干擾素。（3）抗誘變劑，抑制紫外線、亞砷酸鈉、黃曲霉菌B1誘發(fā)的染色體畸變和姐妹染色單體交換效應(yīng)。對(duì)腫瘤的預(yù)防提供了有效措施，對(duì)人類健康具有深遠(yuǎn)的意義。鑒于環(huán)境中誘變物質(zhì)對(duì)人類健康的威脅，已成為迫切需要解決的問題。目前公認(rèn)的翼狀胬肉發(fā)生原因?yàn)?/p>

22、紫外線照射致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。鍺132的抗誘變作用具有高度的有效性和普遍性，且無(wú)蓄積作用，因此認(rèn)為是一種可行的抗誘變劑。PCNA是一種核內(nèi)蛋白，是DNA復(fù)制時(shí)聚合酶的輔助物，其出現(xiàn)與細(xì)胞增殖有明顯關(guān)系，在靜止期的細(xì)胞內(nèi)含量很少，從G1晚期開始增加，S期達(dá)高峰，G2、M1期明顯下降。被認(rèn)為是一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，且可直觀了解細(xì)胞增殖狀況的研究指標(biāo)11。通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)PCNA表達(dá)的檢測(cè)，揭示鍺132可通過間接抑制S期的DNA復(fù)制而達(dá)到其抗增殖作用。綜上所述，本研究從不同角度證實(shí)鍺132具有很強(qiáng)的抗增殖作用，且在一定藥物終濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性，提示鍺132有可能成為新型抗增殖藥物，但尚須進(jìn)一步研究和

23、確認(rèn)其抗增殖作用的機(jī)制。鑒于藥物作用在體內(nèi)外具有一定的差異，我們擬進(jìn)一步觀察和研究鍺132對(duì)動(dòng)物活體眼藥效及毒性反應(yīng)，以便確定有效治療濃度和最佳給藥途徑，為治療和預(yù)防翼狀胬肉的復(fù)發(fā)尋找新方法。與MMC比較，鍺132僅抑制細(xì)胞的過度增殖，而不造成細(xì)胞毒性反應(yīng)，雖然其抗增殖作用弱于MMC，但由于其毒性低，仍不失為很有研究?jī)r(jià)值的抗增殖新藥。作者單位：劉陽(yáng)(100005 北京市眼科研究所)孫憲麗(100005 北京市眼科研究所)李彬(100005 北京市眼科研究所)王津津(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)參考文獻(xiàn)1.胥佩菱，主編. 抗癌藥物合成設(shè)計(jì). 北京：北京醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，

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