靶向OPN的miRNA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549順鉑敏感性的影響

1、靶向OPN的miRNA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549順鉑敏感性的影響    摘要 目的 通過miRNA介導(dǎo)RNAi沉默OPN表達(dá)探討其對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549順鉑(DDP)敏感性的影響。方法 利用體外構(gòu)建的靶向OPN的miRNA表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549,酶聯(lián)免疫吸咐法(ELISA)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48h細(xì)胞OPN蛋白表達(dá);轉(zhuǎn)染后24、48、72、96h,四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染聯(lián)合5g/mL順鉑作用后細(xì)胞的增殖;于轉(zhuǎn)染后24h聯(lián)合不同濃度的順鉑作用48h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果 (1)轉(zhuǎn)染后48h,OPN蛋白表達(dá)水平下調(diào)了47.34

2、%(P<0.01)。(2)轉(zhuǎn)染后24h細(xì)胞增殖開始受抑制(P<0.05),48、72、96h細(xì)胞增殖被明顯抑制,細(xì)胞增殖活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(3)轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑作用24 h細(xì)胞增殖開始受抑(P<0.05),48、72、96h細(xì)胞增殖明顯受抑,細(xì)胞增殖活性轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組及非特異性轉(zhuǎn)染組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后24h聯(lián)合不同濃度的順鉑作用48h,當(dāng)順鉑濃度為2.5、5、10、20g/mL時(shí),細(xì)胞增殖被明顯抑制,細(xì)胞增殖抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 靶向OPN的miRNA抑制人肺腺癌細(xì)胞A549增殖,增強(qiáng)細(xì)胞

3、對(duì)DDP的敏感性。 關(guān)鍵詞 肺腺癌; OPN; miRNA; 順鉑 中圖分類號(hào) R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1673-9701(2010)05-04-04 Effects of miRNA Specific for OPN on Cisplatin Sensitivity of Lung Adenocarcinoma Cell Line TANG Rong1 JIE Kemin2 YU Xiaochun3 ZHU Weifeng2 YU Lehan2 ZHU Bailu1 1.Medical Department,Graduate School of Nanchang Univer

4、sty,Nanchang 330006,China;2.Department ofBiochemistry and Molecular Biology,Medical College of Nanchang University,Nanchang 330006,China;3.Institute of Acupuncture and Moxibustion,China Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences,Beijing 100700,China AbstractObjective To explore the drug sensit

5、ivity of lung adenocarcinoma cell line A549 to cisplatin(DDP) by miRNA specific for OPN gene. MethodsMicroRNA targeting OPN gene was transfected transiently to A549 cells by the expression plasmids which were constructed in vitro. The level of OPN protein in the A549 cells at 48 h after transfection

6、 was measured with ELISA. The cells incubated and non-incubated with 5g/mL DDP were detected by MTT at 24,48,72 and 96 h after transfection. And the cells were cultured at different concentrations of cisplatin(DDP) for 48h,the growth inhibition rate was evaluated by MTT. Results(1)The OPN protein le

7、vel was decreased by 47.34% at 48 h after transfection(P<0.01). (2)The cell proliferation started to be inhibited at 24 h after transfection(P<0.05),and was significantly inhibited at 48,72 and 96 h after transfection,with a significant difference(P<0.01). (3)After the treatment with 5g/mL

8、DDP,the cell proliferation started to be inhibited at 24h after transfection(P<0.05),and was significantly inhibited at 48,72 and 96h after transfection,with a significant difference in the cell proliferation activity between the transfection group and non-transfection group or non-specific trans

9、fection group(P<0.01). At 2.5,5,10 and 20g/mL DDP,the cell proliferation was significantly inhibited,with a significant difference in the cell proliferation inhibition rate(P<0.01). ConclusionMicroRNA targeting OPN gene can effectively inhibite the cell proliferation of lung adenocarcinoma cel

10、l line and enhances the cell chemosensitization to DDP. Key wordsLung adenocarcinoma; OPN; miRNA; Cisplatin 肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,我國肺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)且發(fā)病年齡日趨年輕化1。骨橋蛋白(OPN)與腫瘤的生長轉(zhuǎn)移及血管發(fā)生密切相關(guān)2,作為腫瘤標(biāo)志物和基因治療的靶點(diǎn)日益受到關(guān)注。RNA干擾(RNAi)廣泛用于抑制基因表達(dá)和研究基因功能,它由microRNA(miRNA)和小分子干擾RNA(siRNA)兩種小RNA分子介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)研究miRNA介導(dǎo)的RNAi特異沉默

11、OPN表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞DDP敏感性的影響,為肺癌的化療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法 1.1 材料 A549細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存,DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。重組質(zhì)粒PcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR-OPN/Negative、脂質(zhì)體lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自Promega公司;大腸桿菌菌株One Shot TOP10購自北京全氏金公司;細(xì)胞蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司。人OPN ELISA試劑盒購自武漢博士德生物科技公司。大觀霉素(spectinomycin)、四甲基偶氮

12、唑鹽(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品。順鉑購自山東羅欣藥業(yè)公司。 1.2 方法 1.2.1 miRNA重組質(zhì)粒的擴(kuò)增與純化 -80冰箱取出100L TOP10冰上融化后每100L加入特異性干擾質(zhì)粒(miRNA-OPN)和陰性對(duì)照質(zhì)粒(miRNA-negative control)各2g混勻,冰浴30min。42水浴90s,冰上放置1min后加入37溫育的LB培養(yǎng)基100L,37 200rpm/min水平振搖1h。各取100L轉(zhuǎn)化菌涂布于LB/spectinomycin(50g/mL)固體瓊脂平板上,37恒溫過夜,單個(gè)菌落為轉(zhuǎn)化菌落。用滅菌的10LTip頭各挑取3個(gè)單克隆菌落接種到LB/ spec

13、tinomycin液體培養(yǎng)基中,37搖菌過夜,設(shè)置不加轉(zhuǎn)化菌的陰性對(duì)照。次日收集細(xì)菌,按說明書快速提取小量質(zhì)粒DNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度和260/280吸光度比值。 1.2.2 肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞按5×105/孔移至六孔板,細(xì)胞80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組。未轉(zhuǎn)染組不轉(zhuǎn)染miRNA,轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染miRNA-OPN,陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染miRNA-negative control,每組三個(gè)復(fù)孔。按照Lipofectamine 2000說明書操作,4h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 1.2.3 ELISA法檢測(cè)OPN的表達(dá)

14、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞加250L蛋白裂解液于4,30min裂解細(xì)胞。BCA法總蛋白定量。取裂解上清液按OPN說明書操作,酶標(biāo)分析儀測(cè)定450nm吸光度(A)值。CurveExpert1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算樣品中OPN含量。  1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞增殖抑制率 A549細(xì)胞在6孔板中轉(zhuǎn)染miRNA后24h接種96孔板,細(xì)胞密度為(3×103)個(gè)/孔,每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后更換終濃度為5g/mL DDP的DMEM培養(yǎng)液,分別在24、48、72、96h加入5 mg/mLMTT溶液20L,繼續(xù)培養(yǎng)4h后離心棄上清加入150 L DMSO震蕩

15、10min,酶標(biāo)分析儀測(cè)定490nm吸光度(A)值,作細(xì)胞增殖曲線。細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate,IR)的檢測(cè)為轉(zhuǎn)染后24h加入不同濃度的順鉑(0、1.25、2.5、5、10、20 g/mL)繼續(xù)作用48h后測(cè)定吸光度(A)值,測(cè)定方法同上。設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取平均值。IR的計(jì)算方法是(1-A試驗(yàn)組/ A對(duì)照組)×100%,計(jì)算細(xì)胞對(duì)順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50)。 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS 13.0 分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,多組間參數(shù)采用單因素方差分析,多組間參數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn),不同時(shí)點(diǎn)的計(jì)量資料處理

16、應(yīng)采用重復(fù)資料的方差分析。 2 結(jié)果 2.1 miRNA轉(zhuǎn)染后OPN蛋白抑制 ELISA結(jié)果表明miRNA-OPN能有效沉默OPN蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48h轉(zhuǎn)染組,未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組細(xì)胞蛋白水平分別413.47、785.20、759.93pg/mL。轉(zhuǎn)染組降為未轉(zhuǎn)染組的52.66%(F=274.88,P<0.01),而陰性對(duì)照組為96.78%,與未轉(zhuǎn)染組差異無顯著性,見圖1。 2.2 miRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖情況 分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96h加入MTT溶液測(cè)定A值。轉(zhuǎn)染組,未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組在24h分別為1.08±0.07,1.23±0.09,1.21

17、77;0.09;48h為1.36±0.11,1.84±0.16,1.81±0.16;72h為1.54±0.13,2.20±0.19,2.17±0.16;96h為1.71±0.14,2.39±0.21,2.42±0.22。轉(zhuǎn)染組A549生長速度明顯減慢(圖2),各組細(xì)胞A值比較差異均有顯著性(方差分析,24h F=4.84,P<0.05, 4896h F值分別為:26.70,31.62,22.85,P<0.01),其中轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)組和陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(q檢驗(yàn),24h P<0.05

18、, 4896h P<0.01),表明靶向沉默OPN基因表達(dá)后,細(xì)胞的增殖能力明顯下降。 2.3 miRNA聯(lián)合順鉑作用后細(xì)胞的增殖抑制情況 轉(zhuǎn)染后24h加入DDP(5g/mL)繼續(xù)作用48h,分別在24、48、72、96h加入MTT測(cè)定A值。在DDP的作用下,轉(zhuǎn)染組,未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組在24h分別為1.03±0.07,1.21±0.10,1.19±0.10;48h為0.41±0.03,0.68±0.05,0.65±0.04,72h為0.29±0.01, 0.49±0.02,0.47±0.03,96

19、h為0.18±0.01,0.33±0.02,0.32±0.02。轉(zhuǎn)染組生長受抑更為明顯(圖3),各組細(xì)胞A值比較差異有顯著性(方差分析,24h F=6.19,P<0.05,4896h F值分別為:67.53, 83.69,129.74,P<0.01),其中轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(q檢驗(yàn),24h P<0.05,4896h P<0.01)。在轉(zhuǎn)染24 h后加入不同濃度的順鉑(1.25、2.5、5、10、20g/mL)繼續(xù)作用48h,MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組IR分別為(26.58±0.04)%、(2

20、0.00±0.04)%、(22.66±0.05)%;(60.87±0.07)%、(41.30±0.05)%、(44.57±0.06)%;(77.72±0.06)%、(63.04±0.06)%、(64.67±0.07)%;(85.87±0.08)%、(73.91±0.07)%、(73.37±0.07)%;(92.93±0.06)%、(82.60±0.06)%、(81.52±0.05)%。與未轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組比較,順鉑濃度為1.25g/mL時(shí),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

21、義(F=2.69,P>0.05);順鉑濃度分別為2.5、5、10、20 g/mL時(shí),轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑作用組細(xì)胞增殖被明顯抑制,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為:31.22,67.53, 93.78,121.48,P<0.01)。見圖4。順鉑的IC50由3.20g/mL下降為2.05g/mL。 3 討論 OPN是首先在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種磷酸化糖蛋白,它在組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)。早期它被稱為骨基質(zhì)蛋白,T淋巴細(xì)胞活化蛋白(Eta-1)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白。人OPN 基因由位于4號(hào)染色體上的單拷貝基因編碼,包含314個(gè)氨基酸殘基,其分子量介于4175 KD,這種分子量的差異主要是由轉(zhuǎn)錄后修飾的不同

22、引起。OPN分子富含天冬氨酸和絲氨酸殘基,不同種屬動(dòng)物都具有特異性保守序列,包括710個(gè)連續(xù)的Asp序列,信號(hào)肽序列,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(ArgGly-Asp,RGD)序列,酪氨酸激酶磷酸化識(shí)別序列。通過這些基序,OPN與不同受體分子相互作用,介導(dǎo)多樣的生物學(xué)功能3如骨的礦化、吸收和形成,細(xì)胞黏附、趨化和遷移,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),免疫調(diào)節(jié),血管發(fā)生和抑制細(xì)胞凋亡等。OPN在多種正常組織和細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。許多類型的腫瘤如:乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、卵巢癌和黑色素瘤OPN表達(dá)都升高,且與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外,OPN在一些轉(zhuǎn)移癌病人的全血和血漿中也有高表達(dá)4。Hu5等對(duì)479例非小細(xì)胞

23、肺癌組織的研究表明,腫瘤組織OPN陽性表達(dá)率明顯升高,且與腫瘤的大小、分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外,病人血漿OPN水平明顯高于健康人和肺部良性病變病人,各期肺癌病人有顯著性差異。Boldrini6等研究表明,OPN的表達(dá)是期非小細(xì)胞肺癌病人惡性進(jìn)展的重要指標(biāo),與病人的生存率緊密相關(guān)。與OPN生物功能密切相關(guān)的基序7主要有二個(gè)與整合素,三個(gè)與CD44結(jié)合的位點(diǎn)和一個(gè)凝血酶裂解位點(diǎn)。通過v3整合素、FAK、PI3K、Akt、ERK和NF-B信號(hào)通路的調(diào)節(jié),利用不同濃度的整合素和OPN處理A549細(xì)胞后,細(xì)胞的遷移能力顯著提高8。除此以外,OPN還含有糖基化位點(diǎn)、鈣離子,肝素結(jié)合位點(diǎn),基質(zhì)金屬蛋白酶酶切位點(diǎn)

24、,經(jīng)剪切后一些隱含于蛋白氨基酸鏈內(nèi)部的受體結(jié)合部位被暴露出來,從而介導(dǎo)與多種受體的結(jié)合。有研究表明MMP-9與原發(fā)性肺癌及肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)9。 RNAi廣泛用于抑制基因表達(dá)和研究基因功能。它是指細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(dsRNA)時(shí),mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。RNAi可由miRNA和siRNA兩種形式的小RNA介導(dǎo)。siRNA在腫瘤基因治療方面取得了重大進(jìn)展。研究表明靶向OPN的siRNA能有效沉默基因表達(dá),使細(xì)胞生長速度減慢,侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱,并抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長10-14。最近越來越多的研究人

25、員通過模擬體內(nèi)天然miRNA的成熟過程,利用帶有pol啟動(dòng)子的表達(dá)載體表達(dá)具有miRNA前體結(jié)構(gòu)的shRNA來進(jìn)行RNAi的研究,且具有更強(qiáng)的RNA干擾效應(yīng)15。由慢病毒介導(dǎo)的miRNA干擾抑制肝癌細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)從而使細(xì)胞生長速度明顯減慢,細(xì)胞侵襲能力減弱16。本研究使用的干擾質(zhì)粒由 Invitrogen公司構(gòu)建,可在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)靶向調(diào)控OPN基因的miRNA。該質(zhì)粒以鼠miR-154序列為骨架,且?guī)в芯藜?xì)胞病毒啟動(dòng)子,并優(yōu)化莖環(huán)結(jié)構(gòu)確保目的基因的高效敲除率。該質(zhì)粒帶有加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EmGFP)基因,可很方便地示蹤miRNA的表達(dá)情況,并提供了EmGFP表達(dá)與miRNA基因敲除效率

26、的強(qiáng)對(duì)比。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48h后,OPN蛋白水平下降了47.34 %。在轉(zhuǎn)染48、72、96h后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長曲線明顯下移,細(xì)胞生長速度減慢。說明抑制OPN表達(dá)后,A549細(xì)胞的惡性增殖得到一定控制,為肺癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。  DDP是肺癌臨床治療的首選藥物。它是細(xì)胞周期非特異性藥物,可以和細(xì)胞內(nèi)堿基結(jié)合,造成DNA結(jié)構(gòu)和功能損傷,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑作用后細(xì)胞生長受抑制,與單純DDP作用的細(xì)胞組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)順鉑濃度分別為2.5、5、10、20 g/mL時(shí),轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑作用后A549細(xì)胞的增殖被明顯抑制,IR分別為

27、(60.87±0.07)%、(77.72±0.06)%、(85.87±0.08)%和(92.39±0.06)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。順鉑的IC50由3.20g/mL下降為2.05g/mL。有研究表明特異性沉默表皮生長因子受體(EGFR)基因表達(dá)能增強(qiáng)A549對(duì)DDP治療的敏感性18。Xie19等人應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)分析由慢病毒介導(dǎo)的靶向ATP結(jié)合盒亞家族ABCC2基因表達(dá)下調(diào)后,細(xì)胞內(nèi)DDP濃度增加了23倍,細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性增強(qiáng)19。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明一些基因的表達(dá)與順鉑耐藥緊密相關(guān),其機(jī)制還不十分清楚,其可能的解釋包

28、括細(xì)胞對(duì)DDP解毒增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的改變,DNA修復(fù)能力的增強(qiáng)以及抑制細(xì)胞凋亡等17。DDP的應(yīng)用有劑量限制性,最重要的是它的神經(jīng)毒性導(dǎo)致的周圍神經(jīng)病變、耳鳴、聽力喪失及耐藥性的產(chǎn)生。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,有效沉默OPN表達(dá)能增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性,從而降低DDP的毒副作用和耐藥性的產(chǎn)生,改善病人預(yù)后,為肺腺癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),但其臨床應(yīng)用仍是一個(gè)需要解決的問題。 參考文獻(xiàn) 1 葛海波. 近10年我院肺癌病例發(fā)病特征分析J. 臨床肺科雜志,2009, 14(9):1183-1184. 2 Irby RB,SM McCarthy,TJ. Yeatman. Osteopontin reg

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