陽春砂3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的克隆及分析

1、陽春砂3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的克隆及分析                 作者：楊錦芬，何國振，阿迪卡利，徐暉，何瑞，詹若挺，陳蔚文 【摘要】  目的克隆陽春砂萜類生物合成途徑上游關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC：4)的編碼基因;分析基因的功能及其在陽春砂不同組

2、織中的表達(dá)。方法用基于RT-PCR的方法從陽春砂葉片中獲得編碼HMGR的cDNA全長序列，克隆基因編碼區(qū);用生物信息學(xué)的方法對其編碼蛋白進(jìn)行相似性檢索和功能分析;用半定量RT-PCR法比較基因在陽春砂不同組織中的表達(dá)差異。結(jié)果獲得了全長2 023 bp的編碼陽春砂HMGR的cDNA序列，命名為AvHMGR(GenBank登記號：FJ455511)。AvHMGR編碼的蛋白與其他植物來源的HMGR有很高相似性，含有NADPH結(jié)合基序和底物HMG-CoA結(jié)合基序，N-端有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。保守功能結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果表明AvHMGR屬于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶家族。AvHMGR在包括莖、根、果

3、皮和種子團(tuán)的廣泛組織中表達(dá)，且在這些組織中的表達(dá)量均高于在葉片中的表達(dá)。結(jié)論從陽春砂中克隆了AvHMGR基因，為進(jìn)一步鑒定基因功能、探明陽春砂萜類生物合成的基因調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  陽春砂; 萜類化合物; 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR); 基因克隆; 基因表達(dá) Abstract：ObjectiveTo clone the gene encoding 3-hydroding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase(HMGR,EC:4),the key enzyme of biosynth

4、etic pathways of terpenoids,from Amomum villosum and analyze its function and expression in different tissues of Amomum villosum. MethodsMethod based on RT-PCR by using degenerate primers and rapid amplification of cDNA ends(RACE) was used to clone gene.Bioinformatic analysis was used to identify th

5、e gene.Semi-quantitative RT-PCR was carried out to analyze the expressional difference of the gene in different tissues. ResultsA cDNA encoding HMGR(designated as AvHMGR,GenBank accession number FJ455511) was isolated from leaves of Amomum villosum for the first time.The full-length cDNA of AvHMGR w

6、as 2023 bp containing an open reading frame(ORF) of 1713 bp encoding 571 amimo acids.Bioinformatic analysis revealed that the deduced protein AvHMGR had extensive sequence similarities to other plant HMGRs and was more homologous with HMGRs from monocotyledonous plants.AvHMGRs had two NADPH binding

7、motifs and two HMG-CoA binding motif.Two transmembrane regions were found in its N-terminal region.Result of CDD search indicated that it belonged to the HMGR super-family.AvHMGR expressed in leaves,stems,roots,pericarps and seeds of Amomum villosum and lower transcription level was observed in leav

8、es than that of other tissues.    ConclusionAvHMGR encodes HMGR in Amomum villosum. Key words：Amomum villosrm; Terpenoids; 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase(HMGR); Gene colning; gene expression 砂仁是我國著名的“四大南藥”之一，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎等功效。陽春砂Amomum villosum Lour.是砂仁藥材的主要來源植

9、物1。砂仁化濕行氣的主要藥效物質(zhì)為揮發(fā)油，其主要成分為萜類化合物1,2。近年來，萜類化合物代謝的研究成為目前藥用植物次生代謝研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，萜類化合物生物合成途徑相關(guān)酶類的編碼基因也不斷被克隆和研究35。 甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway，簡稱MVA途徑)和丙酮酸/磷酸甘油醛途徑(pyruvate/glyceraldehyde-3-phosphate pathway，簡稱DXP途徑)是植物萜類化合物生物合成的兩條途徑，MVA途徑在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，而DXP途徑發(fā)生在質(zhì)體中3。兩條途徑并不完全獨(dú)立，而是有著相互關(guān)聯(lián)，一條途徑被抑制后，能被另一條途徑部分補(bǔ)償

10、6，7。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC：4)催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸的不可逆反應(yīng)是MVA途徑的第1個(gè)限速步驟，是萜類生物合成上游途徑中的重要調(diào)控點(diǎn)8。HMGR基因已經(jīng)從長春花Catharanthus roseus9，水稻Oryza sativa10，橡膠樹Hevea brasiliensis11，桑樹Morus alba12，大戟Euphorbia Pekinensis13，馬鈴薯Solanum tuberosum14

11、，喜樹Camptotheca acuminata15，杜仲Eucommia ulmoides16，辣椒Capsicum annuum17，銀杏Ginkgo biloba18，紅豆杉Taxus media19等多種植物包括藥用植物中克隆。 本研究用簡并引物RT-PCR結(jié)合RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法，從陽春砂葉片中克隆了編碼HMGR的基因，通過生物信息學(xué)分析初步鑒定了基因的功能，用半定量RT-PCR法分析了基因在不同組織中的表達(dá)差異，為保護(hù)陽春砂的基因資源，進(jìn)一步探明陽春砂藥效物質(zhì)萜類成分生物合成的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。 1 材料 1.1 植物材

12、料用于基因克隆的陽春砂引種自廣東陽春市砂仁試驗(yàn)示范場，栽種于廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城藥圃。 用于基因表達(dá)分析的陽春砂幼苗培養(yǎng)方法：取陽春砂種子用細(xì)砂搓去假種皮，浸種24 h后播種于盛有營養(yǎng)土與粗砂比例為31的基質(zhì)的育苗盆中室溫光照培養(yǎng)，待幼苗長出24片真葉后間苗，每盆(直徑12 cm)留取生長一致的苗23株，待苗齡約6個(gè)月(長出79片真葉)時(shí)取第1位完全展開葉、莖和根，用于基因表達(dá)分析。陽春砂成熟果實(shí)取自陽春春灣，液氮速凍后-70保存?zhèn)溆谩?#160;   1.2 試劑植物RNA提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)公司);PrimeScript RT-PCR Kit、1st

13、 Strand cDNA Synthesis Kit、Ex Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、克隆載體pMD18-T(寶生物工程大連有限公司);柱式植物RNAout試劑盒(北京天澤基因公司);克隆載體pGEM-T(美國，Promega);SMART RACE Kit(美國，Clontech);大腸桿菌E.coli菌株DH5(本實(shí)驗(yàn)室保存);Taq DNA聚合酶、DNA回收試劑盒(北京賽百盛生物工程公司);引物由上海生工生物工程公司合成;測序由上海生工生物工程公司和上海英濰捷基(invitrogen)公司完成。 2 方法 2.1 目的基因核心片段的擴(kuò)增 2.1.1 簡并引物設(shè)計(jì)

14、從GenBank上檢索來源于單子葉植物的HMGR序列，獲得水稻、玉米、薯蕷的HMGR序列(登記號分別為NM-001070076，Y09238，DQ017377)。用Omiga2.0軟件對上述序列進(jìn)行比對，根據(jù)其高度同源區(qū)域設(shè)計(jì)2對用于嵌套PCR的簡并引物AH1，AH3和AH2，AH4。引物序列見表1。 2.1.2 總RNA的提取取0.1 g新鮮葉片，用植物RNA提取試劑盒，參照說明書的方法提取總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性，測定OD260與OD280，確定總RNA的濃度與純度。 2.1.3 RT-PCR取總RNA 2 g，用PrimeScript RT-PCR Kit，參照說

15、明書的方法，以O(shè)ligo(dT)為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。下一步以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以AH1、AH3為引物進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系(20 l)：Ex Taq酶(5 U?l-1) 0.1 l，10×PCR buffer 2 l，dNTP(10 mM) 1.5 l，上游引物(10 M) 0.75 l，下游引物(10 M) 0.75 l，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.5 l，ddH2O 13 l。PCR反應(yīng)程序：94 3 min;94 0.5 min，54 0.5 min，72 1 min，37個(gè)循環(huán);72 5 min。以引物AH2、AH4進(jìn)行2nd PCR，模板取1st PCR產(chǎn)物1 l，退火溫度為53，其余與1s

16、t PCR相同。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)特異條帶后，按比例擴(kuò)大體積至100 l進(jìn)行PCR。用DNA回收試劑盒，參照說明書的方法回收PCR產(chǎn)物，用相應(yīng)的簡并引物進(jìn)行測序。 2.1.4 核心片段的確認(rèn)登陸NCBI/BLAST(/BLAST/)，將測序結(jié)果進(jìn)行Blastn(nucleotide blast)檢索，檢驗(yàn)所獲片段與已知的其他植物HMGR序列的相似性。 2.2 目的基因3端及5端的克隆 2.2.1 RACE引物的設(shè)計(jì)用于3-RACE的反轉(zhuǎn)錄引物R3以及用于PCR的下游引物R3P1見表1。根據(jù)“2.1.4”項(xiàng)下獲得的核心片段

17、序列和RACE試劑盒的引物設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)相應(yīng)的3-RACE上游引物AH31和5-RACE下游引物AH51、AH52。見表1。    2.2.2 3'-RACE以總RNA為模板、R3為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再以R3P1、AH31為引物，參照前“2.1.3”項(xiàng)下的PCR反應(yīng)體系及程序，調(diào)整相應(yīng)的退火溫度和延伸時(shí)間進(jìn)行PCR?；厥誔CR目的片段，連接至pMD18-T載體，熱擊法20轉(zhuǎn)化E.coli DH5，以經(jīng)PCR檢測的陽性菌落用載體通用引物測序。 2.2.3 5'-RACE用SMART RACE Kit，參照說明書的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以試劑盒中的

18、UPM和NUP為上游引物，分別與目的基因的5-RACE特異引物AH51、AH52配對，以LA Taq酶進(jìn)行PCR?；厥誔CR目的片段，克隆至pGEM-T載體，用載體通用引物測序。 2.3 cDNA全序列的拼接及編碼區(qū)的克隆用Omiga2.0軟件，對3-RACE和5-RACE的測序結(jié)果進(jìn)行分析，去除載體序列，利用NCBI的“Blast 2 Sequences”功能，將3和5端序列分別與“2.1.4”項(xiàng)下獲得的核心序列進(jìn)行比對和拼接，獲得cDNA全長序列，再用Omiga2.0軟件分析其開放閱讀框架(ORF)，翻譯成氨基酸序列。用NCBI的Blastp程序?qū)λ@的氨基酸序列進(jìn)行同源檢索，初步確認(rèn)獲得

19、的翻譯蛋白是否為HMGR的同源蛋白及其完整性。根據(jù)cDNA全序列中編碼區(qū)的兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物AHO1和AHO2(表1)，以“2.1.3”項(xiàng)下獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增編碼區(qū)全長。將回收片段克隆至pGEM-T載體，選2個(gè)以上陽性克隆進(jìn)行測序和序列分析。表1 陽春砂AvHMGR克隆所用引物 2.4 基因編碼蛋白分析及序列提交 用DNAstar5.0軟件分析目的基因編碼蛋白的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。登陸http:/hc.ims.u-tokyo.ac.jp/iPSORT/，采用iPSORT運(yùn)算法則對蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。登陸http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2

20、.0/，對蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域在線預(yù)測。利用NCBI的Blastp程序?qū)Π被嵝蛄羞M(jìn)行同源檢索。登陸/Structure/cdd/cdd.shtml，利用保守功能域數(shù)據(jù)庫(conserved domain database，CDD)進(jìn)行蛋白保守功能域的在線預(yù)測21。用DNAMAN5.0軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制。登陸/BankIt/，向GenBank提交AvHMGR的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列。 2.5 基因表達(dá)分析 2.5.1 RNA提取葉片、根和莖的總RNA提取

21、按照“2.1.2”的方法進(jìn)行。用柱式植物RNAout，參照說明書的方法進(jìn)行果皮和 種子團(tuán)總RNA的提取。 2.5.2 反轉(zhuǎn)錄用1st Strand cDNA Synthesis Kit，參照說明書的方法進(jìn)行。 2.5.3 半定量PCR根據(jù)芭蕉和三七的18S rRNA基因序列(EF376005和D85171)的比對結(jié)果，設(shè)計(jì)引物18SF、18SR(表2)，擴(kuò)增半定量RT-PCR體系的內(nèi)參照18S rRNA。設(shè)計(jì)引物AHR2、AHR3(表2)，擴(kuò)增目的基因片段(約640 bp)。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行半定量PCR。反應(yīng)體系(20 l)：10×PCR buffer 2 l，Dye(PCR染

22、料)2 l，dNTP(10 mM)1.5 l，上游引物(10 M)0.5 l，下游引物(10 M)0.5 l，Taq DNA聚合酶(5U?l-1)0.2l，根據(jù)18S rRNA的擴(kuò)增結(jié)果調(diào)整相應(yīng)模板的用量，滅菌超純水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序：94 2 min;94 0.5 min，55 0.5 min，72 1 min，29個(gè)循環(huán)(18S rRNA)或30個(gè)循環(huán)(AvHMGR)。每個(gè)反應(yīng)取5 l PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物亮度。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次以上。表2 AvHMGR半定量RT-PCR所用引物    3 結(jié)果 3.1 RNA提取結(jié)果從陽

23、春砂嫩葉中提取總RNA，電泳結(jié)果如圖1所示，28S和18S rRNA條帶清晰，無DNA污染，RNA濃度約為1g?l-1。 3.2 AvHMGR核心片段擴(kuò)增及3-RACE、5-RACE結(jié)果如圖2 所示，1st PCR和2nd PCR分別獲得約650 bp的目的片段。1st PCR產(chǎn)物測序結(jié)果獲得618 bp的序列，Blastn檢索結(jié)果顯示，該序列與其他植物來源的HMGR序列有較高相似性(75%77%)。M.DL2000 DNA marker M. DL2000 DNA marker1，2. 葉片總RNA 1. 2nd PCR 2. 1st PCR圖1 陽春砂葉片 圖2 AvHMGR核心總RNA電

24、泳圖 片段的擴(kuò)增 通過3-RACE獲得約750 bp的片段(圖3A)，測序得到以polyA結(jié)尾的761 bp的序列，Blastn檢索結(jié)果顯示，該序列與其他植物來源的HMGR序列3端有較高相似性(69%78%)。 通過5-RACE獲得約1 200 bp的片段(圖3B)，測序得到1 222 bp的序列，Blastn檢索結(jié)果顯示，該序列與其他植物來源的HMGR 5端序列有較高相似性(74%80%)。 3.3 AvHMGR全長cDNA的拼接及其編碼區(qū)的克隆將克隆獲得的5端1 222 bp、核心片段618 bp與3端 761 bp的序列進(jìn)行拼接，獲得了AvHMGR的cDNA全長，共2 023 bp，包含

25、5 端92 bp的非編碼區(qū)、1 713 bp的ORF和3端218 bp的非編碼區(qū)，最后以polyA結(jié)尾，編碼571個(gè)氨基酸。 以引物AHO1和AHO2擴(kuò)增獲得編碼區(qū)(圖3C)，測序得到1 775 bp的插入序列。2個(gè)陽性克隆的測序結(jié)果驗(yàn)證了全長cDNA拼接序列的正確性。向GenBank提交陽春砂AvHMGR的cDNA全序列及其編碼的氨基酸序列，獲得序列登記號FJ455511及對應(yīng)的蛋白序列登記號ACR02667。 3.4 AvHMGR編碼蛋白的分析 根據(jù)軟件分析的結(jié)果，AvHMGR編碼蛋白的分子量為60.5 kDa，等電點(diǎn)為7.405。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，AvHMGR蛋白的N-端沒有信號肽

26、或線粒體、葉綠體靶向轉(zhuǎn)運(yùn)肽?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，在其N-端有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖5)，第一個(gè)位于第36位異亮氨酸(I)和第55位甲硫氨酸(M)之間，第二個(gè)位于第68位亮氨酸(L)到第90位亮氨酸(L)之間，兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間的肽鏈位于膜內(nèi)，之外的肽鏈主要位于膜外。AvHMGR具有NADPH結(jié)合位點(diǎn)“DAMGMNM”和“GTVGGGT”，也具有和底物HMG-CoA的結(jié)合位點(diǎn)“ELPIGYVQLP”和“TTEGCLVA”(見圖5)。 3.5 AvHMGR與其他植物HMGR蛋白的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Blastp結(jié)果表明，AvHMGR蛋白與來源于其他植物的HMGR蛋白有廣泛相似性。表3列出了AvHM

27、GR與文獻(xiàn)報(bào)道的其他10個(gè)植物HMGR蛋白1019的序列比對結(jié)果，相似性達(dá)到77%89%。M1. DL2000 DNA markerM2. 250 bp DNA marker1. 3端 2. 5端 3.編碼區(qū)圖3 AvHMGR 3端、5端以及編碼區(qū)的擴(kuò)增表3 AvHMGR與其他10個(gè)植物HMGR蛋白相似性比較    AvHMGR與其他10個(gè)植物HMGR的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果如圖4所示，11種HMGR的分子進(jìn)化關(guān)系與其來源植物的親緣關(guān)系基本一致，AvHMGR與同為單子葉植物的水稻OsHMGR聚為一枝。圖4 AvHMGR與其他10個(gè)植物HMGR蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化

28、樹對AvHMGR與水稻、杜仲和大戟的HMGR多重比對結(jié)果(圖5)顯示，它們的相似保守區(qū)域主要集中在N-端第30至第100位氨基酸區(qū)域和第155位氨基酸之后的C-端區(qū)域。推測N-端的保守區(qū)域可能與HMGR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域相關(guān)，而C-端保守區(qū)域與HMGR蛋白的催化功能相關(guān)。 3.6 AvHMGR功能預(yù)測用AvHMGR的序列進(jìn)行CDD搜索，結(jié)果顯示AvHMGR蛋白歸屬于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶超級家族(cl00205: HMG-CoA_reductase Super-family)中的HMGR類酶(cd00643：Hydroxymethylglutaryl-coenzyme A redu

29、ctase, class I enzyme)，為同源四聚體。 3.7 AvDXR1半定量RT-PCR結(jié)果如圖6所示，根據(jù)半定量RT-PCR的結(jié)果，AvHMGR在莖、根、果皮和種子團(tuán)中的表達(dá)量高于在葉片中的表達(dá)量。黑色、深灰色和灰色描影分別示序列相似性為100%、75%和50%;AvHMGR、OsHMGR、EuHMGR與EpHMGR分別來源于陽春砂、水稻、杜仲和大戟;上劃線區(qū)域示兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，帶星號標(biāo)注的4個(gè)序列分別為NADPH結(jié)合位點(diǎn)“DAMGMNM”和“GTVGGGT”，及HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)“E(L/M)P(I/V)G(Y/F)(V/L)Q(L/I)P”和“TTEGCLVA”圖5 Av

30、HMGR與OsHMGR、EuHMGR、EpHMGR的多重比對1. 葉 2. 莖 3. 根 4. 果皮 5. 種子團(tuán)圖6 AvHMGR在陽春砂不同組織中的半定量RT-PCR結(jié)果 4 討論 本研究應(yīng)用簡并引物RT-PCR與RACE結(jié)合的方法，首次從陽春砂葉片中克隆了AvHMGR基因。AvHMGR基因cDNA全長2 023 bp，編碼蛋白包含571個(gè)氨基酸，與其他植物來源的HMGR有較高相似性。對AvHMGR蛋白序列的CDD檢索結(jié)果顯示，AvHMGR屬于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原異構(gòu)酶(HMGR)家族，這一類酶在萜類生物合成途徑中催化甲羥戊酸的合成，在植物中是細(xì)胞質(zhì)萜類化合物代謝中的重要調(diào)控

31、點(diǎn)。自然界存在兩類HMGR，類型主要存在于真核生物，在其N-端有跨膜結(jié)構(gòu)域，類型主要存在于原核生物，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，檢索結(jié)果顯示AvHMGR蛋白屬于HMGR類酶。AvHMGR也具有植物HMGR典型的NADPH結(jié)合位點(diǎn)(NADPH為HMGR催化的還原反應(yīng)提供還原力)，也具有底物HMG-CoA的結(jié)合位點(diǎn)，其中“TTEGCLVA”中的谷氨酸Glu在HMGR催化中具有重要作用22。HMGR是一類定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白8，N-端具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域是目前克隆獲得的植物HMGR編碼蛋白的共有特征22。陽春砂AvHMGR蛋白的N-端也具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，推測這與其定位于細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，行使其催化功能相關(guān)。

32、這與已知的MVA途徑發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中是相符的。通過以上生物信息學(xué)的分析，初步證明了克隆獲得的AvHMGR是陽春砂萜類生物合成途徑關(guān)鍵酶HMGR的編碼基因。    EuHMGR在杜仲葉和莖部的表達(dá)量高于根部的表達(dá)量16，EpHMGR在大戟的根、莖、葉中均有表達(dá)，在根部的表達(dá)量最高13。本研究對AvHMGR在陽春砂不同組織中的表達(dá)分析顯示，AvHMGR也在陽春砂的不同組織中廣泛表達(dá)，在根、莖和果皮、種子團(tuán)中的表達(dá)均高于在葉片中的表達(dá)。由于果實(shí)是陽春砂的主要藥用部位，AvHMGR在果實(shí)中的表達(dá)對于陽春砂萜類生物合成的原位調(diào)控具有重要意義。 本研究克隆獲得了陽春砂

33、AvHMGR基因，分析了該基因在不同組織中的表達(dá)，為進(jìn)一步鑒定該基因的功能打下基礎(chǔ)，為將其應(yīng)用于萜類藥效成分生物合成的基因工程調(diào)控提供依據(jù)。 致謝：廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心劉艷、黃瓊林、寧鑫、吳睿等研究生參與了植物培養(yǎng)、果實(shí)取樣的工作，廣東陽春市砂仁試驗(yàn)示范場蘇景場長提供了陽春砂種苗，特此致謝。 【參考文獻(xiàn)】  1 劉軍民,劉春玲,徐鴻華.砂仁M.北京:中國中醫(yī)藥出版社,2001:1.2 胡玉蘭,張忠義,林敬明.中藥砂仁的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展J.中藥材,2005,28(1):72.3 羅永明,黃璐琦,劉愛華,等.植物萜類化合物的生物合成途徑及其關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展J

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