【1】生物樣本中蛋白質(zhì)的提取及測(cè)定(分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn))

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱：生物樣本中蛋白質(zhì)的提取及測(cè)定姓 名： 陳 杰 學(xué) 號(hào)： 3140104666 組 別： 同組同學(xué)： 唐陳曦 帶教教師： 劉偉 俞萍 實(shí)驗(yàn)日期： 2015年9月15日 目錄1.原理：31.1生物樣本中蛋白質(zhì)的提取31.2生物樣本中蛋白質(zhì)的測(cè)定31.2.1 Lowry法31.2.2 考馬斯亮藍(lán)法31.2.3 紫外吸收法42.操作步驟42.1生物樣本中蛋白質(zhì)的提取42.2生物樣本中蛋白質(zhì)的測(cè)定42.2.1 Lowry法42.2.2 考馬斯亮藍(lán)法52.2.3紫外吸收法53、實(shí)驗(yàn)結(jié)果53.1 原始數(shù)據(jù)53.1.1 Lowry法53.1.2 考馬斯亮藍(lán)法63.1.3 紫外吸

2、收法63.2 數(shù)據(jù)處理73.2.1 Lowry法73.2.2 考馬斯亮藍(lán)法83.2.3 紫外吸收法94.討論：101.原理：1.1生物樣本中蛋白質(zhì)的提取離體不久的組織，在適宜的溫度及pH等條件下，可以進(jìn)行一定程度的物質(zhì)代謝。因此，在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常利用離體組織來(lái)研究各種物質(zhì)代謝的途徑與酶系作用，也可以從組織中提取各種代謝物質(zhì)或酶進(jìn)行研究。但生物組織離體過(guò)久，其所含物質(zhì)的含量和生物活性都將發(fā)生變化。例如，組織中的某些酶在久置后會(huì)發(fā)生變性而失活；有些組織成分如糖原、ATP等，甚至在動(dòng)物死亡數(shù)分鐘至十幾分鐘內(nèi)，其含量即有明顯的降低。因此，利用離體組織作代謝研究或作為提取材料時(shí)，都必須迅速將它取出，

3、并盡快地進(jìn)行提取或測(cè)定。一般采用斷頭法處死動(dòng)物，放出血液，立即取出實(shí)驗(yàn)所需的臟器或組織，除去外層的脂肪及結(jié)締組織后，用冰冷的生理鹽水洗去血液（必要時(shí)可用冰冷的生理鹽水灌注臟器以洗去血液），再用濾紙吸干，即可用于實(shí)驗(yàn)。取出的臟器或組織，可根據(jù)不同的方法制成不同的組織樣品。包括組織糜、組織勻漿、組織浸出液。由于動(dòng)物肝臟細(xì)胞比較脆弱，易于破碎，故本實(shí)驗(yàn)選用小鼠肝臟細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，采用勻漿法法將其破碎，然后加入樣品提取液使蛋白質(zhì)溶解，用高速離心法棄去細(xì)胞碎片。收集上清液后可進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。1.2生物樣本中蛋白質(zhì)的測(cè)定1.2.1 Lowry法1921年，F(xiàn)olin發(fā)明了Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白

4、質(zhì)的濃度，反應(yīng)原理是利用蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸殘基還原酚試劑（磷鎢酸-磷淚酸）生成藍(lán)色化合物；1951年Lowry對(duì)上述方法進(jìn)行了改進(jìn)，讓蛋白質(zhì)先與堿性銅試劑進(jìn)行反應(yīng)，然后再與酚試劑反應(yīng)，改進(jìn)后的方法可以使反應(yīng)的靈敏度提高。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性溶液中能與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫色或紫紅色絡(luò)合物（類似雙縮脲反應(yīng)）。由于蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸殘基(酪氨酸）的存在，該絡(luò)合物在堿性條件下進(jìn)而與Folin-酚試劑形成藍(lán)色復(fù)合物。上述呈色反應(yīng)的顏色深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量成正比。通過(guò)與已知含量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的生色結(jié)果進(jìn)行比較分析，即可檢測(cè)待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的快速定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法

5、中，以Lowry等人發(fā)展的Folin-酣法應(yīng) 用最為普遍。該方法的優(yōu)點(diǎn)是:靈敏度高（比紫外吸收法靈敏度高1020倍），操作簡(jiǎn)單快速，不需復(fù)雜的儀器設(shè)備。1.2.2 考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由掠黑色變?yōu)樗{(lán)色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的械性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍(lán)G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈青色，在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。1.2.3 紫外吸收法蛋白質(zhì)中普遍含有酪氨酸與色氨酸，由于這兩種芳香族氨基

6、酸分子中含有大pi鍵，它們?cè)?80nm紫外光附近有光吸收，因而使蛋白質(zhì)在上述紫外光波長(zhǎng)附近產(chǎn)生較強(qiáng)的光吸收，利用蛋白質(zhì)的這一特性可對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。2.操作步驟2.1生物樣本中蛋白質(zhì)的提取1.用頸椎脫白法處死小鼠，切開腹腔，取下完整肝臟，小心去掉膽囊（不要弄破），放入盛 冷生理鹽水的燒杯中漂洗干凈。2.取小鼠肝整個(gè)肝組織，在稱量紙上剪碎，放入玻璃勾裝管中。3.按1:15的比例往玻璃勾紫管中加入勾裝緩沖液（即每份樣品需加預(yù)冷的提取緩沖液6mL，蛋白酶抑制劑0.16mL)，手動(dòng)勻漿。注意用力均勾，以免損壞勻漿管。 4.勻漿完成后，取一支2mL eppendorf管，各加入1.8mL勾衆(zhòng)液后，置入冷

7、凍離心中。5. 5.于4,13000r/min離心20min后，小心取出上清液0.5ml至2mLeppendorf管中，加入0.5ml緩沖液，用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，再取出上清液0.5ml至另一2mLeppendorf管中-20保存。2.2生物樣本中蛋白質(zhì)的測(cè)定2.2.1 Lowry法1.取16mmxl50mm試管16支，標(biāo)號(hào)，放置在試管架上，在16號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取貯液用雙蒸水稀釋至0.5mg/ML）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.5mL，在7、8號(hào)試管內(nèi)分別加入待測(cè)樣品25、50uL，并用雙蒸水補(bǔ)足至0.5mL(即將待測(cè)樣品

8、稀釋20或10倍）。916管作為平行實(shí)驗(yàn)管重復(fù)18管的操作并同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取算術(shù)平均值作為檢測(cè)結(jié)果。 2.各管加入2.5mL新配制的堿性銅溶液，立即搖勻，在室溫下放置10min。3.各管加入0.5mL Folin 酚試劑應(yīng)用液，邊加入邊立即充分混合（用振蕩混合器），然后在室溫下放置3060min(不要超過(guò)60min)。4.分別用1號(hào)和9號(hào)管作為空白對(duì)照調(diào)零，檢測(cè)其余標(biāo)準(zhǔn)樣品管及待測(cè)樣品管在550nm波長(zhǎng)處的吸光度值。5.根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量。2.2.2 考馬斯亮藍(lán)法1.

9、取16mmx150mm試管16支，標(biāo)號(hào)，放置在試管架上，在16號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取e液用雙蒸水稀釋至0.5mg/mL)0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.1mL，在7.8號(hào)試管內(nèi)分別加入稀釋20、10倍的待測(cè)樣品0.1mL。 916管作為平行實(shí)驗(yàn)管重復(fù)18管的操作并同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取算術(shù)平均值作為檢測(cè)結(jié)果。 2.每管加入考馬斯亮藍(lán)G250染料試劑3mL，搖勾，室溫靜置3min3.分別用1號(hào)和9號(hào)管作為空白對(duì)照調(diào)零，檢測(cè)其余標(biāo)準(zhǔn)樣品管及待測(cè)樣品管在595nm 處的吸光度值。4.根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根

10、據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量。2.2.3紫外吸收法1.取16mmx 150mm試管16支，標(biāo)號(hào)，放置在試管架上，在16號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（2mg/mL)0、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積3mL，在7,8號(hào)試管內(nèi)分別加入稀釋100,50倍的待測(cè)樣品3mL。916管作為平行實(shí)驗(yàn)管重復(fù)18管的操作并同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取算術(shù)平均值作為檢測(cè)結(jié)果。2.分別以1號(hào)管和9號(hào)管作為空白對(duì)照調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)(注意用石英比色杯)于波長(zhǎng)280nm處比色，記錄各管的吸光度值。3.根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣

11、品測(cè)得的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算小鼠肝提取液的蛋白質(zhì)含量。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 原始數(shù)據(jù)3.1.1 Lowry法序 號(hào)12345678牛血清蛋白濃度（mg/mL）00.10.20.30.40.5一號(hào)組 吸光度值00.1820.3040.4000.4540.4840.3230.519二號(hào)組 吸光度值00.1690.3030.3920.4430.4950.3420.517算術(shù)平均值00.17550.30350.3960.44850.48950.33250.5183.1.2 考馬斯亮藍(lán)法序 號(hào)12345678牛血清蛋白濃度（mg/mL）0

12、0.10.20.30.40.5一號(hào)組 吸光度值00.1430.2620.3530.4190.5700.4090.739二號(hào)組 吸光度值00.1550.2840.3670.5220.5790.4120.780算術(shù)平均值00.1490.2730.3600.47050.57450.41050.75953.1.3 紫外吸收法序 號(hào)12345678牛血清蛋白濃度（mg/mL）00.20.30.40.50.6一號(hào)組 吸光度值00.1330.1970.2560.3240.3800.2290.405二號(hào)組 吸光度值00.1160.1970.2550.3160.3840.2000.408算術(shù)平均值00.1245

13、0.1970.25550.3200.3820.21450.40653.2 數(shù)據(jù)處理3.2.1 Lowry法將y=0.3325代入擬合出的直線：y=0.95971x+0.06224中可得濃度為0.28mg/ mL，原樣品中蛋白質(zhì)濃度為5.6mg/mL，則原來(lái)的濃度為11.2 mg/mL。將y=0.518代入擬合出的直線：y=0.95971x+0.06224中可得濃度為0.48mg/ mL，則原樣品中蛋白質(zhì)濃度為4.8mg/mL，則原來(lái)的濃度為9.6 mg/mL。 取平均值為10.4mg/mL。3.2.2 考馬斯亮藍(lán)法將y=0.4105代入擬合出的直線：y=1.12114x+0.02421中可得濃

14、度為0.34mg/mL，則樣品中蛋白質(zhì)濃度為6.8mg/mL，則原來(lái)的濃度為13.6 mg/mL。將y=0.7595代入擬合出的直線：y=1.12114x+0.02421中可得濃度為0.66mg/mL，則樣品中蛋白質(zhì)濃度為6.6mg/mL，則原來(lái)的濃度為13.2 mg/mL。 取平均值為13.4mg/mL。3.2.3 紫外吸收法將y=0.2145代入擬合出的直線：y=0.63886x+0.00021中可得濃度為0.34mg/mL，則樣品中蛋白質(zhì)濃度為6.8mg/mL，則原來(lái)的濃度為13.6 mg/mL。將y=0.4065代入擬合出的直線：y=0.63886x+0.00021中可得濃度為0.64

15、mg/mL，則樣品中蛋白質(zhì)濃度為6.4mg/mL，則原來(lái)的濃度為12.8 mg/mL。取平均值為13.2mg/mL。4.討論：根據(jù)三種方法得出蛋白質(zhì)的濃度約為13.3 mg/mL（沒(méi)有算第一種方法得出的結(jié)果，因?yàn)榉椒ㄒ恢械腞-square值只有0.9169），從后兩種方法的回歸線中可以看出還是很符合實(shí)驗(yàn)規(guī)律的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我更喜歡第二種方法。我們?cè)谶x擇方法的時(shí)候主要考慮：實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液中存在的干擾物質(zhì)；測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。其中Lowry靈敏度高，不需要復(fù)雜儀器，但反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)，操作的用時(shí)也有比較高的要求，同時(shí)容易受到非蛋白質(zhì)的影響，例如含

16、有EDTA，甘氨酸等物質(zhì)的蛋白就不適合這種方法。之所以第一組數(shù)據(jù)尤其不準(zhǔn)，我想與我們組的操作水平不無(wú)關(guān)系，因?yàn)镕olin-酚試劑只有在酸性條件下穩(wěn)定，但還原反應(yīng)只在堿性條件下發(fā)生，所以加入的時(shí)候要立即混勻，可能這個(gè)沒(méi)有做好，另外就是實(shí)驗(yàn)室里分光光度計(jì)調(diào)整用了好久。再就是考馬斯亮藍(lán)法，靈敏度高，測(cè)定簡(jiǎn)便，只要加一種試劑，而且染料的顏色可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。我們組做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候是先一起做完Lowry法和考馬斯亮藍(lán)法之后去測(cè)定的，而調(diào)整分光光度計(jì)用時(shí)了很久，所以這種方法即時(shí)過(guò)了一段時(shí)間，測(cè)出來(lái)的數(shù)據(jù)也還很準(zhǔn)，不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。并且該法干擾物質(zhì)很少，像K+,Na+，Mg+離子，EDTA等等的都不干擾。使用過(guò)考馬斯亮藍(lán)染液的比色杯比較難清洗，可以用乙醇脫色后再用清水清洗，注意少量多次。最后是紫外吸收法，相對(duì)于前兩種方法最大的優(yōu)勢(shì)就是速度很快，操作很簡(jiǎn)單，也不需要消耗樣品，測(cè)定后能回收使用。如果要測(cè)定來(lái)源比較珍貴的，不容易獲取的蛋白質(zhì)濃度可以考慮這種方法。不過(guò)也有很多缺點(diǎn)，例如準(zhǔn)確度較差、如果樣品中有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾，同時(shí)敏感度也比較低，對(duì)蛋白的濃度要求較高。注意測(cè)試時(shí)必須使用石英比色杯。同時(shí)有幾