穴位埋藥線和電針干預(yù)對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬熱休克蛋白70表達(dá)的影響

1、穴位埋藥線和電針干預(yù)對(duì)腦缺血再灌注大鼠海馬熱休克蛋白7070表達(dá)的影響作者：孔立紅，高珊，陳振江，彭松【摘要】目的觀察局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)及川茸嗪緩釋劑穴位埋藥線和電針干預(yù)對(duì)其的影響。方法將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、電針組、穴 位埋藥線 組。采用改良線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型 及以膠原川勞嗪制備的緩釋劑(藥線)在大椎、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴位埋藥線。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)不同時(shí)相(24、72、120 h)各組大鼠海馬HSP70的表胞，治療各組大腦海馬HSP70表達(dá)均增加，24 h時(shí)HSP70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，以后逐漸下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

2、意義(PV(作者:單位:郵編:達(dá)。結(jié)果正常組及假手術(shù)組大鼠海馬僅見(jiàn)少量HSP70卩日性細(xì)0.01)o其中穴位埋藥線組大腦海馬HSP70表達(dá)最為明顯，與電針組 比 較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PV0.05)。結(jié)論川茸嗪穴位埋藥線可誘導(dǎo)腦 缺血 再灌注后HSP70表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，作用優(yōu)于電針組?！娟P(guān)鍵詞】局灶性腦缺血；川茸嗪；穴位埋藥；電針；大鼠海馬;熱休克蛋白70Abstract: Objective To observe the effects of embedding impla ntatio n of collagen and Tetramethylpyraz ine in acupo i

3、nts and electroacupuncture on the express!onof HSP70 in hippocampus of rat with focal cerebral ischemia reperfusion. MethodsSD rats were ran domly divided in to no rmal group, sham operati on group, modelgroup, electroacupuncture group, embedding medicine in acupoints group. Model oflocal ischemia w

4、as made by middle cerebral artery occlusi on, preparati on of implantati on collage n and electro- acupuncture andTetramethyl pyrazine was embedded in the acupo ints of Dazhui andNeigua n two-sided. The expressi on of HSP-70 protein in hippocampus of different time poi nt (24, 72, 120 h) was assayed

5、 by immun ohistochemistry. Results Therewere only few positive cells of HSP-70 in normal group and sham operation group.The expressi on of HSP-70 in each therapy group were all heighte ned, and achievedthe peak 24 h later and the n decii ned in brain tissue after focal cerebralischemiareperfusio n,

6、the differences were relatively prominent com pared with thesame p base model group (P v 0.01). The exp ressi on of HSP-70 in creased in embedding medic ine group sig ni fica ntly compared with the electro-acupuncture group(P v 0.05). ConclusionEmbeddi ng implan tation of collage n and Tetramethyl p

7、yrazine in acupo ints canin crease the exp ressi on of HSP-70 in hippo cam pus of rats with cerebral ischemiareperfusion, which may protect neuronal cells after cerebral ischemia reperfusionin rats.Key words : cerebral ischemia reperfusion ;Tetramethylpyraz ine ； embeddi ng medic ine in points ; ele

8、ctroacupuncture : rathippocampus ; HSP-70川勞嗪對(duì)急慢性缺血性腦血管病具有肯定的治療效果。 膠原藥物緩釋劑的研究及應(yīng)用在國(guó)內(nèi)外都取得顯著成效。熱休克蛋白70(HSP70)是腦缺血后應(yīng)激反應(yīng)合成的特殊蛋白質(zhì)之明它是神經(jīng)損傷的一種早期指標(biāo)1 O HSP70表達(dá)增強(qiáng)，能減輕腦缺血后的神經(jīng)元損傷，是缺血損傷時(shí)敏感而可靠的指標(biāo)2。因此，我們以膠 原川茸嗪制備緩釋劑(藥線)在大椎、 雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴埋藥， 電針大椎、 雙側(cè) 內(nèi)關(guān)穴，觀察埋藥和電針后對(duì)HSP70表達(dá)的影響。1材料與方法1.1動(dòng)物及分組清潔級(jí)健康SD大鼠98只，雌雄不限,體重為(200 i20)g,由華中科技

9、大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于實(shí)驗(yàn)前1周一次性購(gòu)進(jìn)，飼養(yǎng)于安靜、溫暖且避強(qiáng)光的環(huán)境中，室溫(22 2)C,自由飲水進(jìn)食。隨機(jī)分為5組：正常組6只，假手術(shù)組、模型組、電針組、穴位埋藥線組， 各18只。余下20只以造模備用。，多項(xiàng)研究表1.2膠原川茸嗪緩釋劑(藥線)的制備采用酸溶解法從大鼠尾腱提取膠原蛋白3,與川茸嗪(北京市永康藥業(yè)有限公司)按照2 1比例制成藥線，常溫干燥，紫外線照射消毒，備用。1.3試劑及主要儀器HSP70單克隆抗體、DAB顯色試劑，購(gòu)自北京中山生物有限公司。日產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡；日產(chǎn)Nik on數(shù)碼照相機(jī)。1 4大鼠局灶性腦缺血再灌注模型復(fù)制及篩選選擇直徑為0.2

10、6-0.28 mm單股縫合尼龍線，長(zhǎng)60 mm,將 插入端加熱熔化，使之成為光滑球面，直徑約0.30 mm,用酒精清潔后 置于生理鹽水中備用。局灶性腦缺血再灌注模型的建立采用改良線栓法4。大mL/100 g)進(jìn)行腹腔麻醉并保溫。麻醉大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上， 常規(guī) 皮膚消毒后，頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA),分離岀頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)o電凝ECA入腦分支，結(jié)扎游離ECA主干，分 離ICA主干至翼腭動(dòng)脈(PPA),并在其起始部位置一動(dòng)脈夾。先將CCA用動(dòng)脈夾夾住，再在ECA殘端剪0.2 mm的小口，將栓線插入。輕推尼 龍線 尾端經(jīng)CCA分叉部沿ICA入顱,至大腦中動(dòng)脈(

11、MCA),遇阻即止。尼龍線 插入深度約18 mm,30 min后，抽取栓線對(duì)大鼠進(jìn)行再灌注，縫 合切口后, 用碘酒消毒，動(dòng)物保溫喂養(yǎng)，注意觀察造模大鼠生理指征。采用Zea 鼠造模前禁食不禁水24 h,稱(chēng)重后，以10%水合氯醛(0 3longa3評(píng)分方法，當(dāng)造模大鼠清醒后，即評(píng)定動(dòng)物神經(jīng)功能缺 損。0分：正常。1分：對(duì)側(cè)肢體屈曲。2分：拖住尾巴后拉時(shí)，對(duì)側(cè) 肢體無(wú) 力。3分：拖住尾巴后拉時(shí)，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。4分：自發(fā)向?qū)?cè)轉(zhuǎn) 圈或傾 倒。5分：無(wú)任何自發(fā)活動(dòng)。只有神經(jīng)功能障礙在1分以上的大鼠才視 為成功模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，共有7只大鼠造模后死亡或不成 功，用備用 的大鼠補(bǔ)充，全部造模成功。1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)

12、物處理正常組：6只，正常給水給食，不予處理。假手術(shù)組：18只，大鼠麻醉切 開(kāi)頸部皮膚后，僅分離CCA, ECA及ICA至PPA,不插線栓。按時(shí)相分為24、72、120h 3組，各6只。模型組：18只，栓塞30 min后 再灌注。按時(shí)相分為24、72、120h3組，各6只。電針組：18只，栓塞30 min后再灌注。按時(shí)相分為24、72、120h3組，各6只。造模成功后進(jìn)行電針 治療，參照文獻(xiàn)4方法，取大椎、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，用32號(hào)0 5寸毫針針刺;大椎與缺血側(cè)（右側(cè)）內(nèi)關(guān)接通G-6805電針治療儀，采用連續(xù)波，頻率120次/min,強(qiáng)度1 mA,以局部肌肉輕微抖動(dòng)為度，每次持續(xù)刺激30 min。穴位

13、埋藥線組：18只，栓塞30 min后再灌注。按時(shí)相分為24、72、120 h3組，各6只。大鼠選取大椎穴、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴進(jìn)行治療（同電針組）。自制藥線長(zhǎng)約2mm,其中藥物含量約0 2mg。 將藥線裝入注射針頭， 穴位直 刺3mm,輕推針柄將藥線埋入，然后將注射針頭緩慢退出，埋藥處常規(guī)消 毒。各治療組均在缺血再灌注后1 h治療1次,以后每日治療1次，分別 治療1、3 5 d后取材，取材當(dāng)天不予處理。動(dòng)物完成觀察時(shí)間后，各組于各時(shí)相，以10%水合氯醛按標(biāo)準(zhǔn)量麻醉大鼠，開(kāi)胸暴露心臟，將灌注針頭從心尖部位插入升主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳,依次迅速灌注20 C的0.9%氯化鈉溶液200 mL、4 C的4%多聚甲醛2

14、00 mL（含0,1%DEPC）灌畢迅速取腦，在視交叉平面前后2 mm處將腦冠狀切面切開(kāi)，留取中間部分置于4C的4%多聚甲醛固定液中過(guò) 夜。常規(guī)上行脫水、透明后用石蠟包埋，連續(xù)切片,切片厚5卩 0 每隔10張取1張，使每1張切片上都有海馬，然后在60 C左右的 溫水中充分 展開(kāi)，用玻片貼片。每份組織取2張待用。采用免疫組化法（SABC法）。切片經(jīng)常規(guī)脫臘、脫水、3%H2O2滅 活內(nèi)源性酶、 微波抗原修復(fù)， 正常山羊血清封閉， 滴加HSP70單克隆 抗體一抗（1 50）,37C孵育120 mino滴加1滴相應(yīng)二抗,SABC反應(yīng),DAB顯色，蘇木素不復(fù)染。分色、脫水、透明、封片、光學(xué)顯微鏡 下觀

15、察各組大鼠病灶側(cè)（右側(cè)），正常組取相對(duì)應(yīng)側(cè)。陰性對(duì)照：用正常山羊 血清代替一抗。1 7圖像分析在光鏡下HSP70蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核及細(xì)胞漿染成棕黃 色。采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)（華中科技 大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院千屏影像公司生產(chǎn)）對(duì)切片進(jìn)行圖像分析。在40X10倍光鏡 視野下，實(shí)驗(yàn)各組片海馬區(qū)域中隨機(jī)取8個(gè)非重疊的視野，測(cè)定HSP70免疫陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值并進(jìn)行分析。平均灰度值在圖像分 析中用來(lái)表示圖像的透光率，分為256級(jí),最黑為0級(jí),最亮為256級(jí)，平 均灰度值越高，說(shuō)明其免疫組化染色越淺，含量越低。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以Xis表示，組間比較若滿(mǎn)足正態(tài)性且

16、方差齊，采用方差分 析和q檢驗(yàn)，否則采用H檢驗(yàn)和q檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均輸入計(jì)算機(jī)，以SPSS11,0軟件統(tǒng)計(jì)包處理。P V 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果（見(jiàn)表1）表1各組大鼠海馬HSP70蛋白不同時(shí)相平均灰度值（略）注：與正常組比較P V0.01;與假手術(shù)組比較，*PV0 01;與模型組比較，探PV0 05,探卩V0.01;與電針組比較,#PV0 05,#PV0,013討論HSPs是細(xì)胞內(nèi)蛋白的一個(gè)家族，熱休克（42 C,20 min）、缺血、缺氧、氧自由基、變性蛋白等刺激均能誘導(dǎo)HSPs表達(dá)，其中，研究最且生物學(xué)意義肯定的是HSP70,且在HSPs家族中含量最為豐富且最保守。正常生理情況下

17、,HSP70基因在腦內(nèi)無(wú)表達(dá)或呈低水平表達(dá)，各種應(yīng)表達(dá)增加。HSP70是比神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生病理表現(xiàn)更為敏感的指標(biāo)。多 項(xiàng)研激情況如熱休克或缺血缺氧等刺激可迅速誘導(dǎo)HSP70基因的究表明HSP70的表達(dá)減輕了大腦中動(dòng)脈栓塞模型損傷的程度和 范圍2 ,HSP70對(duì)腦缺血是一種保護(hù)性因素，也是缺血后組織損傷的早期標(biāo)志，HSP70的存在意味著損傷尚處于可復(fù)階段1 O川茸嗪對(duì)急慢性缺血性腦血管病有肯定的治療效果5。藥理研究表明：川茸嗪作為一種鈣拮抗劑，可改善腦缺血再灌注后的能量代謝、電生理及線粒體功能，抗自由基的氧化作用，對(duì)腦缺血及再灌注后神經(jīng) 細(xì)胞功能有保護(hù)作用6。而緩釋(植入)劑是一種無(wú)菌固體制劑，由藥

18、 物和賦型劑籍熔融、熱壓、輻射等方法制成，具有長(zhǎng)效作用和恒釋作用7 O藥線被植入大椎、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，大椎是督脈上的重要穴位，是手足三陽(yáng)經(jīng)與督脈交會(huì)穴， 是陽(yáng)氣的集中點(diǎn)或窗口， 可調(diào)節(jié)諸陽(yáng)經(jīng)上傳下 達(dá) 督脈為陽(yáng)脈之海，循脊入腦，因此，針刺督脈大椎穴可補(bǔ)益腦髓、醒 腦開(kāi) 竅、疏通腦絡(luò)、活血化瘀。心包位于心的外圍，針刺心包經(jīng)的內(nèi)關(guān)可寧心安神定志。有實(shí)驗(yàn)表明，電針干預(yù)腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制與增強(qiáng)HSP70表 達(dá)和SOD活性,降低大鼠腦組織中自由基含量有關(guān)8。本 實(shí)驗(yàn)也表明, 穴位埋藥與電針治療各組能明顯上調(diào)大鼠缺血側(cè)海馬組 織HSP70蛋白表 達(dá),對(duì)腦缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。且穴位埋藥作為一種新型的給藥途 徑，其效果優(yōu)于電針組(PV0.05)。提示埋藥后可 能通過(guò)藥物的緩慢釋 放和對(duì)穴位的持續(xù)刺激產(chǎn)生長(zhǎng)效作用 物和臉穴的雙重功效， 故能更好地促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后抗凋亡基 因HSP70蛋白表達(dá)，進(jìn)而有效減少腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞 的凋 亡，對(duì)腦起到保護(hù)作用。緩釋劑是近年研究發(fā)展的一種新劑型，臨床運(yùn)用有很好的效果9。膠原中藥緩釋劑穴位埋藥，是一種新的劑型和特殊的治療方法。但因 緩中藥緩釋劑穴位埋藥尚存在許多問(wèn)題，比如與穴位注射的比較、給藥的確切途徑、是否進(jìn)入血腦屏障的藥物濃度更高等，都有待于進(jìn)一步 的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Kato H, Kogure K. Biochemica