2015年藥典生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則

1、生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則一、范圍準(zhǔn)確測(cè)定生物基質(zhì)如全血、血清、血漿、尿中的藥物濃度，對(duì)于藥物和制劑研發(fā)非常重要。這些數(shù)據(jù)可被用于支持藥品的安全性和有效性，或根據(jù)毒動(dòng)學(xué)、藥動(dòng)學(xué)和生物等效性試驗(yàn)的結(jié)果做出關(guān)鍵性決定。因此，必須完整地驗(yàn)證和記錄應(yīng)用的生物分析方法，以獲得可靠的結(jié)果。本指導(dǎo)原則提供生物分析方法驗(yàn)證的要求，也涉及非臨床或臨床試驗(yàn)樣品實(shí)際分析的基本要求，以及何時(shí)可以使用部分驗(yàn)證或交叉驗(yàn)證，來(lái)替代完整驗(yàn)證。本指導(dǎo)原則二和三主要針對(duì)色譜分析方法，四針對(duì)配體結(jié)合分析方法。生物樣品定量分析方法驗(yàn)證和試驗(yàn)樣品分析應(yīng)符合本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求。應(yīng)該在相應(yīng)的生物樣品分析中遵守GLP原則或GCP則。

2、二、生物分析方法驗(yàn)證一分析方法的完整驗(yàn)證分析方法驗(yàn)證的主要目的是，證明特定方法對(duì)于測(cè)定在某種生物基質(zhì)中分析物濃度的可靠性。止匕外，方法驗(yàn)證應(yīng)采用與試驗(yàn)樣品相同的抗凝劑。一般應(yīng)對(duì)每個(gè)新分析方法和新分析物進(jìn)行完整驗(yàn)證。當(dāng)難于獲得相同的基質(zhì)時(shí)，可以采用適當(dāng)基質(zhì)替代，但要說(shuō)明理由。一個(gè)生物分析方法的主要特征包括：選擇性、定量下限、響應(yīng)函數(shù)和校正范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線性能、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、分析物在生物基質(zhì)以及溶液中儲(chǔ)存和處理全過(guò)程中的穩(wěn)定性。有時(shí)可能需要測(cè)定多個(gè)分析物。這可能涉及兩種不同的藥物，也可能涉及一個(gè)母體藥物及其代謝物，或一個(gè)藥物的對(duì)映體或異構(gòu)體。在這些情況下，驗(yàn)證和分析的原則適用于所有涉及的分

3、析物。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在方法驗(yàn)證中，含有分析物對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶液將被加入到空白生物基質(zhì)中。止匕外，色譜方法通常使用適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)。應(yīng)該從可追溯的來(lái)源獲得對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。應(yīng)該科學(xué)論證對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的適用性。分析證書(shū)應(yīng)該確認(rèn)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，并提供儲(chǔ)存條件、失效日期和批號(hào)。對(duì)于內(nèi)標(biāo)，只要能證明其適用性即可，例如顯示該物質(zhì)本身或其相關(guān)的任何雜質(zhì)不產(chǎn)生干擾。當(dāng)在生物分析方法中使用質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，推薦盡可能使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)。它們必須具有足夠高的同位素純度，并且不發(fā)生同位素交換反應(yīng)，以防止結(jié)果的偏差。1. 選擇性該分析方法應(yīng)該能夠區(qū)分目標(biāo)分析物和內(nèi)標(biāo)與基質(zhì)的內(nèi)源性組分或樣品中其他組分。應(yīng)該使用至少6個(gè)受試者的適

4、宜的空白基質(zhì)來(lái)證明選擇性動(dòng)物空白基質(zhì)可以不同批次混合，它們被分別分析并評(píng)價(jià)干擾。當(dāng)干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%寸，通常即可以接受。應(yīng)該考察藥物代謝物、經(jīng)樣品預(yù)處理生成的分解產(chǎn)物以及可能的同服藥物引起干擾的程度。在適當(dāng)情況下，也應(yīng)該評(píng)價(jià)代謝物在分析過(guò)程中回復(fù)轉(zhuǎn)化為母體分析物的可能性。2. 殘留應(yīng)該在方法建立中考察殘留并使之最小。殘留可能不影響準(zhǔn)確度和精密度。應(yīng)通過(guò)在注射高濃度樣品或校正標(biāo)樣后，注射空白樣品來(lái)估計(jì)殘留。高濃度樣品之后在空白樣品中的殘留應(yīng)不超過(guò)定量下限的20%并且不超過(guò)內(nèi)標(biāo)的5%如果殘留不可防止，應(yīng)考慮特殊措施，在方法驗(yàn)證時(shí)檢驗(yàn)并在試驗(yàn)樣品分析時(shí)應(yīng)

5、用這些措施，以確保不影響準(zhǔn)確度和精密度。這可能包括在高濃度樣品后注射空白樣品，然后分析下一個(gè)試驗(yàn)樣品。3. 定量下限定量下限是能夠被可靠定量的樣品中分析物的最低濃度，具有可接受的準(zhǔn)確度和精密度。定量下限是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)，應(yīng)適用于預(yù)期的濃度和試驗(yàn)?zāi)康摹?. 標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)該在指定的濃度范圍內(nèi)評(píng)價(jià)儀器對(duì)分析物的響應(yīng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)加入已知濃度的分析物和內(nèi)標(biāo)到空白基質(zhì)中，制備各濃度的校正標(biāo)樣，具基質(zhì)應(yīng)該與目標(biāo)試驗(yàn)樣品基質(zhì)相同。方法驗(yàn)證中研究的每種分析物和每一分析批，都應(yīng)該有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。在進(jìn)行分析方法驗(yàn)證之前，最好應(yīng)該了解預(yù)期的濃度范圍。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍應(yīng)該盡量覆蓋預(yù)期濃度范圍，由定量下限和定量上限校

6、正標(biāo)樣的最高濃度來(lái)決定。該范圍應(yīng)該足夠描述分析物的藥動(dòng)學(xué)。應(yīng)該使用至少6個(gè)校正濃度水平，不包括空白樣品不含分析物和內(nèi)標(biāo)的處理過(guò)的基質(zhì)樣品和零濃度樣品含內(nèi)標(biāo)的處理過(guò)的基質(zhì)。每個(gè)校正標(biāo)樣可以被多次處理和分析。應(yīng)該使用簡(jiǎn)單且足夠描述儀器對(duì)分析物濃度響應(yīng)的關(guān)系式。空白和零濃度樣品結(jié)果不應(yīng)參與計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)。應(yīng)該提交標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)，測(cè)定校正標(biāo)樣后回算得出的濃度應(yīng)一并提交。在方法驗(yàn)證中，至少應(yīng)該評(píng)價(jià)3條標(biāo)準(zhǔn)曲線。校正標(biāo)樣回算的濃度一般應(yīng)該在標(biāo)示值的土15%Z內(nèi)，定量下限處應(yīng)該在20咖。至少75唳正標(biāo)樣，含最少6個(gè)有效濃度，應(yīng)滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。如果某個(gè)校正標(biāo)樣結(jié)果不符合這些標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該拒絕這一標(biāo)樣，不含這一標(biāo)樣的

7、標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)被重新評(píng)價(jià)，包括回歸分析。最好使用新鮮配制的樣品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，但如果有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)支持，也可以使用預(yù)先配制并儲(chǔ)存的校正標(biāo)樣。5. 準(zhǔn)確度分析方法的準(zhǔn)確度描述該方法測(cè)得值與分析物標(biāo)示濃度的接近程度，表示為：測(cè)得值/真實(shí)值xl00%。應(yīng)采用加入已知量分析物的樣品來(lái)評(píng)估準(zhǔn)確度，即質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品的配制應(yīng)該與校正標(biāo)樣分開(kāi)進(jìn)行，使用另行配制的儲(chǔ)備液。應(yīng)該根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析質(zhì)控樣品，將獲得的濃度與標(biāo)示濃度比照。準(zhǔn)確度應(yīng)報(bào)告為標(biāo)示值的百分比。應(yīng)通過(guò)單一分析批批內(nèi)準(zhǔn)確度和不同分析批批問(wèn)準(zhǔn)確度獲得質(zhì)控樣品值來(lái)評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度。為評(píng)價(jià)一個(gè)分析批中不同時(shí)間的任何趨勢(shì)，推薦以質(zhì)控樣品分析批來(lái)證明準(zhǔn)確度，其樣品數(shù)不少

8、于一個(gè)分析批預(yù)期的樣品數(shù)。批內(nèi)準(zhǔn)確度為了驗(yàn)證批內(nèi)準(zhǔn)確度，應(yīng)取一個(gè)分析批的定量下限及低、中、高濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度至少用5個(gè)樣品。濃度水平覆蓋標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：定量下限，在不高于定量下限濃度3倍的低濃度質(zhì)控樣品，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍中部附近的中濃度質(zhì)控樣品，以及標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍上限約75燦的高濃度質(zhì)控樣品。準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的土15股內(nèi)，定量下限準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的土20%圍內(nèi)。批問(wèn)準(zhǔn)確度通過(guò)至少3個(gè)分析批，且至少兩天進(jìn)行，每批用定量下限以及低、中、高濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度至少5個(gè)測(cè)定值來(lái)評(píng)價(jià)。準(zhǔn)確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的土15%E圍內(nèi)，對(duì)于定量下限，應(yīng)在標(biāo)示值的土20流圍內(nèi)。報(bào)告的準(zhǔn)確度和

9、精密度的驗(yàn)證數(shù)據(jù)應(yīng)該包括所有獲得的測(cè)定結(jié)果，但是已經(jīng)記錄明顯失誤的情況除外。6. 精密度分析方法的精密度描述分析物重復(fù)測(cè)定的接近程度，定義為測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)。應(yīng)使用與證明準(zhǔn)確度相同分析批樣品的結(jié)果，獲得在同一批內(nèi)和不同批問(wèn)定量下限以及低、中、高濃度質(zhì)控樣品的精密度。對(duì)于驗(yàn)證批內(nèi)精密度，至少需要一個(gè)分析批的4個(gè)濃度，即定量下限以及低、中、高濃度，每個(gè)濃度至少5個(gè)樣品。對(duì)于質(zhì)控樣品，批內(nèi)變異系數(shù)一般不得超過(guò)15%定量下限的變異系數(shù)不得超過(guò)20%對(duì)于驗(yàn)證批問(wèn)精密度，至少需要3個(gè)分析批至少2天的定量下限以及低、中、高濃度，每個(gè)濃度至少5個(gè)樣品。對(duì)于質(zhì)控樣品，批間變異系數(shù)一般不得超過(guò)15%定量

10、下限的變異系數(shù)不得超過(guò)20%7. 稀釋可靠性樣品稀釋不應(yīng)影響準(zhǔn)確度和精密度。應(yīng)該通過(guò)向基質(zhì)中加入分析物至高于定量上限濃度，并用空白基質(zhì)稀釋該樣品每個(gè)稀釋因子至少5個(gè)測(cè)定值，來(lái)證明稀釋的可靠性。準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)在15%：內(nèi)，稀釋的可靠性應(yīng)該覆蓋試驗(yàn)樣品所用的稀釋倍數(shù)?？梢酝ㄟ^(guò)部分方法驗(yàn)證來(lái)評(píng)價(jià)稀釋可靠性。如果能夠證明其他基質(zhì)不影響精密度和準(zhǔn)確度，也可以接受其使用。8. 基質(zhì)效應(yīng)當(dāng)采用質(zhì)譜方法時(shí)，應(yīng)該考察基質(zhì)效應(yīng)。使用至少6批來(lái)自不同供體的空白基質(zhì)，不應(yīng)使用合并的基質(zhì)。如果基質(zhì)難以獲得，則使用少于6批基質(zhì)，但應(yīng)該說(shuō)明理由。對(duì)于每批基質(zhì)，應(yīng)該通過(guò)計(jì)算基質(zhì)存在下的峰面積由空白基質(zhì)提取后加入分析物和內(nèi)標(biāo)

11、測(cè)得，與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積分析物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤罕戎?計(jì)算每一分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。進(jìn)一步通過(guò)分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。從6批基質(zhì)計(jì)算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)不得大于15%該測(cè)定應(yīng)分別在低濃度和高濃度下進(jìn)行。如果不能適用上述方式，例如采用在線樣品預(yù)處理的情況，則應(yīng)該通過(guò)分析至少6批基質(zhì)，分別加入高濃度和低濃度定量下限濃度3倍以內(nèi)以及接近定量上限，來(lái)獲得批問(wèn)響應(yīng)的變異。其驗(yàn)證報(bào)告應(yīng)包括分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以及每一樣品的計(jì)算濃度。這些濃度計(jì)算值的總體變異系數(shù)不得大于15%除正?；|(zhì)外，還應(yīng)關(guān)注其他樣品的基質(zhì)效應(yīng)，例如溶血的或高血脂的血漿樣品等。9.

12、 穩(wěn)定性必須在分析方法的每一步驟確保穩(wěn)定性，用于檢查穩(wěn)定性的條件，例如樣品基質(zhì)、抗凝劑、容器材料、儲(chǔ)存和分析條件，都應(yīng)該與實(shí)際試驗(yàn)樣品的條件相似。用文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定性是不夠的。采用低和高濃度質(zhì)控樣品空白基質(zhì)加入分析物至定量下限濃度3倍以內(nèi)以及接近定量上限，在預(yù)處理后以及在所評(píng)價(jià)的條件儲(chǔ)存后立即分析。由新鮮制備的校正標(biāo)樣獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析質(zhì)控樣品，將測(cè)得濃度與標(biāo)示濃度相比較，每一濃度的均值與標(biāo)示濃度的偏差應(yīng)在15%范圍內(nèi)。應(yīng)通過(guò)適當(dāng)稀釋，考慮到檢測(cè)器的線性和測(cè)定范圍，檢驗(yàn)儲(chǔ)備液和工作溶液的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性檢查應(yīng)考察不同儲(chǔ)存條件，時(shí)間尺度應(yīng)不小于試驗(yàn)樣品儲(chǔ)存的時(shí)間。通常應(yīng)該進(jìn)行以下

13、穩(wěn)定性考察： 分析物和內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液和工作溶液的穩(wěn)定性； 從冰箱儲(chǔ)存條件到室溫或樣品處理溫度，基質(zhì)中分析物的冷凍和融化穩(wěn)定性； 基質(zhì)中分析物在冰箱儲(chǔ)存的長(zhǎng)期穩(wěn)定性；止匕外，如果適用，也應(yīng)該進(jìn)行以下考察： 處理過(guò)的樣品在室溫下或在試驗(yàn)過(guò)程儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性； 處理過(guò)的樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器溫度下的穩(wěn)定性。在多個(gè)分析物試驗(yàn)中，特別是對(duì)于生物等效性試驗(yàn)，應(yīng)該關(guān)注每個(gè)分析物在含所有分析物基質(zhì)中的穩(wěn)定性。應(yīng)特別關(guān)注受試者采血時(shí)，以及在儲(chǔ)存前預(yù)處理的基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性，以確保由分析方法獲得的濃度反映受試者采樣時(shí)刻的分析物濃度?？赡苄枰鶕?jù)分析物的結(jié)構(gòu)，按具體情況證明其穩(wěn)定性。二部分驗(yàn)證在對(duì)已被驗(yàn)證的分析方法進(jìn)行

14、小幅改變情況下，根據(jù)改變的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，可能需要部分方法驗(yàn)證?？赡艿母淖儼ǎ荷锓治龇椒ㄞD(zhuǎn)移到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，改變儀器、校正濃度范圍、樣品體積，其他基質(zhì)或物種，改變抗凝劑、樣品處理步驟、儲(chǔ)存條件等。應(yīng)報(bào)告所有的改變，并對(duì)重新驗(yàn)證或部分驗(yàn)證的范圍說(shuō)明理由。三交叉驗(yàn)證應(yīng)用不同方法從一項(xiàng)或多項(xiàng)試驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)，或者應(yīng)用同一方法從不同試驗(yàn)地點(diǎn)獲得數(shù)據(jù)時(shí)，需要互相比較這些數(shù)據(jù)時(shí)，需要進(jìn)行分析方法的交叉驗(yàn)證。如果可能，應(yīng)在試驗(yàn)樣品被分析之前進(jìn)行交叉驗(yàn)證，同一系列質(zhì)控樣品或試驗(yàn)樣品應(yīng)被兩種分析方法測(cè)定。對(duì)于質(zhì)控樣品，不同方法獲得的平均準(zhǔn)確度應(yīng)在土15%圍內(nèi)，如果放寬，應(yīng)該說(shuō)明理由。對(duì)于試驗(yàn)樣品，至少67%羊品測(cè)得的

15、兩組數(shù)值差異應(yīng)在兩者均值的20流圍內(nèi)。三、試驗(yàn)樣品分析在分析方法驗(yàn)證后，可以進(jìn)行試驗(yàn)樣品或受試者樣品分析。需要在試驗(yàn)樣品分析開(kāi)始前證實(shí)生物分析方法的效能。應(yīng)根據(jù)已驗(yàn)證的分析方法處理試驗(yàn)樣品以及質(zhì)控樣品和校正標(biāo)樣，以保證分析批被接受。一分析批一個(gè)分析批包括空白樣品和零濃度樣品，包括至少6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣，至少3個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品低、中、高濃度雙重樣品，或至少試驗(yàn)樣品總數(shù)的5%兩者中取數(shù)目更多者，以及被分析的試驗(yàn)樣品。所有樣品校正標(biāo)樣、質(zhì)控和試驗(yàn)樣品應(yīng)按照它們將被分析的順序，在同一樣品批中被處理和提取。一個(gè)分析批包括的樣品在同一時(shí)間處理，即沒(méi)有時(shí)間問(wèn)隔，由同一分析者相繼處理，使用相同的試劑，保

16、持一致的條件。質(zhì)控樣品應(yīng)該分散到整個(gè)批中，以此保證整個(gè)分析批的準(zhǔn)確度和精密度。對(duì)于生物等效性試驗(yàn)，建議一名受試者的全部樣品在同一分析批中分析，以減少結(jié)果的變異。二分析批的接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在分析試驗(yàn)計(jì)劃或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中，規(guī)定接受或拒絕一個(gè)分析批的標(biāo)準(zhǔn)。在整個(gè)分析批包含多個(gè)部分批次的情況，應(yīng)該針對(duì)整個(gè)分析批，也應(yīng)該針對(duì)分析批中每一部分批次樣品定義接受標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)該使用以下接受標(biāo)準(zhǔn)：校正標(biāo)樣測(cè)定回算濃度一般應(yīng)在標(biāo)示值的15%圍內(nèi)，定量下限應(yīng)在20%范圍內(nèi)。不少于6個(gè)校正標(biāo)樣，至少75%g樣應(yīng)符合這些標(biāo)準(zhǔn)。如果校正標(biāo)樣中有一個(gè)不符合標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)該拒絕這個(gè)標(biāo)樣，重新計(jì)算不含該標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析。質(zhì)控樣品

17、的準(zhǔn)確度值應(yīng)該在標(biāo)示值的土15流圍內(nèi)。至少67頌控樣品，且每一濃度水平至少50%羊品應(yīng)符合這一標(biāo)準(zhǔn)。在不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的情況下，應(yīng)該拒絕該分析批，相應(yīng)的試驗(yàn)樣品應(yīng)該重新提取和分析。在同時(shí)測(cè)定幾個(gè)分析物的情況下，對(duì)每個(gè)分析物都要有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果一個(gè)分析批對(duì)于一個(gè)分析物可以接受，而對(duì)于另一個(gè)分析物不能接受，則接受的分析物數(shù)據(jù)可以被使用，但應(yīng)該重新提取和分析樣品，測(cè)定被拒絕的分析物。如果使用多重校正標(biāo)樣，其中僅一個(gè)定量下限或定量上限標(biāo)樣不合格，則校正范圍不變。所有接受的分析批，每個(gè)濃度質(zhì)控樣品的平均準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)該列表，并在分析報(bào)告中給出。如果總平均準(zhǔn)確度和精密度超過(guò)15%則需要進(jìn)行額外的考察，

18、說(shuō)明該偏差的理由。在生物等效性試驗(yàn)情況下，這可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)被拒絕。三校正范圍如果在試驗(yàn)樣品分析開(kāi)始前，已知或預(yù)期試驗(yàn)樣品中的分析物濃度范圍窄，則推薦縮窄標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，調(diào)整質(zhì)控樣品濃度，或者適當(dāng)加入質(zhì)控樣品新的濃度，以充分反映試驗(yàn)樣品的濃度。如果看起來(lái)很多試驗(yàn)樣品的分析物濃度高于定量上限，在可能的情況下，應(yīng)該延伸標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，加入額外濃度的質(zhì)控樣品或改變其濃度。至少2個(gè)質(zhì)控樣品濃度應(yīng)該落在試驗(yàn)樣品的濃度范圍內(nèi)。如果標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍被改變，則生物分析方法應(yīng)被重新驗(yàn)證部分驗(yàn)證，以確認(rèn)響應(yīng)函數(shù)并保證準(zhǔn)確度和精密度。四試驗(yàn)樣品的重新分析和報(bào)告值選擇應(yīng)該在試驗(yàn)計(jì)劃或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中預(yù)先確定重新分析試驗(yàn)樣品的理由

19、以及選擇報(bào)告值的標(biāo)準(zhǔn)。在試驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)該提供重新分析的樣品數(shù)目以及占樣品總數(shù)的比例。重新分析試驗(yàn)樣品可能基于以下理由： 由于校正標(biāo)樣或質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度或精密度不符合接受標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致一個(gè)分析批被拒絕；,內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)與校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)差異顯著； 進(jìn)樣不當(dāng)或儀器功能異常； 測(cè)得的濃度高于定量上限，或低于該分析批的定量下限，且該批的最低濃度標(biāo)樣從標(biāo)準(zhǔn)曲線中被拒絕，導(dǎo)致比其他分析批的定量下限高； 在給藥前樣品或撫慰劑樣品中測(cè)得可定量的分析物； 色譜不佳。對(duì)于生物等效性試驗(yàn)，通常不能接受由于藥動(dòng)學(xué)理由重新分析試驗(yàn)樣品。在由于給藥前樣品陽(yáng)性結(jié)果或者由于藥動(dòng)學(xué)原因進(jìn)行重新分析的情況下，應(yīng)該提供重新分析樣

20、品的身份、初始值、重新分析的理由、重新分析獲得值、最終接受值以及接受理由。在儀器故障的情況下，如果已經(jīng)在方法驗(yàn)證時(shí)證明了重新進(jìn)樣的重現(xiàn)性和進(jìn)樣器內(nèi)穩(wěn)定性，則可以將已經(jīng)處理的樣品重新進(jìn)樣。但對(duì)于拒絕的分析批，則需要重新處理樣品。五色譜積分應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中描述色譜的積分以及重新積分。任何對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的偏離都應(yīng)在分析報(bào)告中討論。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該記錄色譜積分參數(shù)，在重新積分的情況下，記錄原始和最終的積分?jǐn)?shù)據(jù)，并在要求時(shí)提交。六用于評(píng)價(jià)方法重現(xiàn)性的試驗(yàn)樣品再分析在方法驗(yàn)證中使用校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品可能無(wú)法模擬實(shí)際試驗(yàn)樣品。例如，蛋白結(jié)合、已知和未知代謝物的回復(fù)轉(zhuǎn)化、樣品均一性或同服藥物引起的差異，可能影響

21、這些樣品在處理和儲(chǔ)存過(guò)程中分析物的準(zhǔn)確度和精密度。因此，推薦通過(guò)在不同天后，在另外一個(gè)分析批中重新分析試驗(yàn)樣品，來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)際樣品測(cè)定的準(zhǔn)確度。檢驗(yàn)的范圍由分析物和試驗(yàn)樣品決定，并應(yīng)該基于對(duì)分析方法和分析物的深人理解。建議獲得Cmax附近和消除相樣品的結(jié)果，一般應(yīng)該重新分析10%羊品，如果樣品總數(shù)超過(guò)1000,則超出部分重新分析5%羊品。對(duì)于至少67%勺重復(fù)測(cè)試，原始分析測(cè)得的濃度和重新分析測(cè)得的濃度之間的差異應(yīng)在兩者均值的士20%圍內(nèi)。試驗(yàn)樣品再分析顯示偏差結(jié)果的情況下，應(yīng)該進(jìn)行考察，采取足夠的步驟優(yōu)化分析方法。至少在以下情形下，應(yīng)該進(jìn)行試驗(yàn)樣品的再分析： 毒動(dòng)學(xué)試驗(yàn)，每個(gè)物種一次 所有關(guān)鍵性的

22、生物等效性試驗(yàn) 首次用于人體的藥物試驗(yàn) 首次用于患者的藥物試驗(yàn) 首次用于肝或腎功能不全患者的藥物試驗(yàn)對(duì)于動(dòng)物試驗(yàn)，可能僅需要在早期關(guān)鍵性試驗(yàn)中進(jìn)行實(shí)際樣品的再分析，例如涉及給藥劑量和測(cè)得濃度關(guān)系的試驗(yàn)。四、配體結(jié)合分析配體結(jié)合分析主要用于大分子藥物。前述的驗(yàn)證原則以及對(duì)試驗(yàn)樣品分析的考慮一般也適用。但是由于大分子固有的特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，使其難以被提取，所以常常在無(wú)預(yù)先別離的情況下測(cè)定分析物。止匕外，方法的檢測(cè)終點(diǎn)并不直接來(lái)自分析物的響應(yīng)，而來(lái)自與其他結(jié)合試劑產(chǎn)生的間接信號(hào)。配體結(jié)合分析中，每個(gè)校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品以及待測(cè)樣品一般都采用復(fù)孔分析。如無(wú)特殊說(shuō)明，本節(jié)以雙孔分析為原則。一方法驗(yàn)證前的考

23、量1. 標(biāo)準(zhǔn)品選擇生物大分子具有不均一性，其中成分的效價(jià)與免疫反應(yīng)可能存在差異。因此應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行充分表征。應(yīng)盡量使用純度最高的標(biāo)準(zhǔn)品。用于配制校正標(biāo)樣和標(biāo)準(zhǔn)品批質(zhì)控樣品的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)盡量與臨床和非臨床試驗(yàn)使用的受試品批號(hào)相同。號(hào)變更時(shí)，應(yīng)盡量對(duì)其進(jìn)行表征和生物分析評(píng)價(jià)，以確保方法性能不變。2. 基質(zhì)選擇一般不推薦使用經(jīng)碳吸附、免疫吸附等方法提取過(guò)的基質(zhì)，或透析血清、蛋白緩沖液等替代實(shí)際樣品基質(zhì)建立分析方法。但在某些情況下，復(fù)雜生物基質(zhì)中可能存在高濃度與分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)，具高度干擾導(dǎo)致根本無(wú)法測(cè)定分析物。在無(wú)其他可選定量策略的前提下，可允許使用替代基質(zhì)建立分析方法。但應(yīng)對(duì)使用替代基質(zhì)建立

24、方法的必要性加以證明?？刹捎锰娲|(zhì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，但質(zhì)控樣品必須用實(shí)際樣品基質(zhì)配制，應(yīng)通過(guò)計(jì)算準(zhǔn)確度來(lái)證明基質(zhì)效應(yīng)的消除。3. 最低需求稀釋度確實(shí)定分析方法建立與驗(yàn)證過(guò)程中，可能需要對(duì)基質(zhì)進(jìn)行必要的稀釋，以降低其產(chǎn)生的高背景信號(hào)。在此情況下，應(yīng)考察最低需求稀釋度。它是指分析方法中為提高信噪比、減少基質(zhì)干擾、優(yōu)化準(zhǔn)確度與精密度而必須使用緩沖液對(duì)生物樣品進(jìn)行稀釋的最小倍數(shù)。應(yīng)使用與試驗(yàn)樣品相同的基質(zhì)來(lái)配制加藥樣品來(lái)確定最低需求稀釋度。4. 試齊1J方法的關(guān)鍵試劑，如結(jié)合蛋白、適配子、抗體或偶聯(lián)抗體、酶等，對(duì)分析結(jié)果會(huì)產(chǎn)生直接影響，因此須確保質(zhì)量。如果在方法驗(yàn)證或樣品分析過(guò)程中，關(guān)鍵試劑批次發(fā)生改變

25、，須確認(rèn)方法性能不因此改變，從而確保不同批次結(jié)果的一致性。無(wú)論是關(guān)鍵試劑，還是緩沖液、稀釋液、酸化劑等非關(guān)鍵試劑，都應(yīng)對(duì)維持其穩(wěn)定性的保障條件進(jìn)行記錄，以確保方法性能長(zhǎng)期不變。二方法驗(yàn)證1. 完整驗(yàn)證1標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線反映了分析物濃度與儀器響應(yīng)值之間的關(guān)系。在配體結(jié)合分析方法中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的響應(yīng)函數(shù)是間接測(cè)得的，一般呈非線性，常為S型曲線。應(yīng)使用至少6個(gè)有效校正標(biāo)樣濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。校正標(biāo)樣應(yīng)在預(yù)期定量范圍對(duì)數(shù)坐標(biāo)上近似等距離分布。除校正標(biāo)樣外，可使用錨定點(diǎn)輔助曲線擬合。驗(yàn)證過(guò)程中，須至少對(duì)6個(gè)獨(dú)立的分析批進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以列表形式報(bào)告，以確定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸模型整體的穩(wěn)健性。擬合時(shí)，一條標(biāo)

26、曲允許排除由于明確或不明原因產(chǎn)生失誤的濃度點(diǎn)。排除后應(yīng)至少有75%勺校正標(biāo)樣回算濃度在標(biāo)示值的20%定量下限與定量上限在土25%范圍內(nèi)。定量下限與定量上限之間的濃度范圍為標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍。錨定點(diǎn)校正樣品是處于定量范圍之外的標(biāo)樣點(diǎn)，用于輔助擬合配體結(jié)合分析的非線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，因其在定量范圍之外，可不遵循上述接受標(biāo)準(zhǔn)。2特異性特異性是指在樣品中存在相關(guān)干擾物質(zhì)的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確、專一地測(cè)定分析物的能力。結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)或預(yù)期合用藥物應(yīng)不影響方法對(duì)分析物的測(cè)定。如在方法建立與驗(yàn)證階段無(wú)法獲取結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)，特異性評(píng)價(jià)可在最初方法驗(yàn)證完成后補(bǔ)充進(jìn)行。應(yīng)采用未曾暴露于分析物的基質(zhì)配制高濃度與低濃度

27、質(zhì)控樣品，加入遞增濃度的相關(guān)干擾物質(zhì)或預(yù)期合用藥物進(jìn)行特異性考察。未加入分析物的基質(zhì)也應(yīng)同時(shí)被測(cè)量。要求至少80犯上的質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度在土20%范圍內(nèi)如果在定量下限水平，則在土25流圍內(nèi)，且未加入分析物的基質(zhì)的測(cè)量值應(yīng)低于定量下限。3選擇性方法的選擇性是指基質(zhì)中存在非相關(guān)物質(zhì)的情況下，準(zhǔn)確測(cè)定分析物的能力。由于生物大分子樣品一般不經(jīng)提取，基質(zhì)中存在的非相關(guān)物質(zhì)可能會(huì)干擾分析物的測(cè)定。應(yīng)通過(guò)向至少10個(gè)不同來(lái)源的基質(zhì)加入定量下限和定量上限水平的分析物來(lái)考察選擇性，也應(yīng)同時(shí)測(cè)量未加入分析物的基質(zhì)。選擇性考察要求至少80姒上的樣品準(zhǔn)確度在土20%5圍內(nèi)如果在定量下限水平，則在土25%S圍內(nèi)，且未加入分

28、析物的基質(zhì)的測(cè)量值應(yīng)低于定量下限。如果干擾具有濃度依賴性，則須測(cè)定發(fā)生干擾的最低濃度。在此情況下，可能需要在方法驗(yàn)證之前調(diào)整定量下限。根據(jù)項(xiàng)目需要，可能需要針對(duì)病人群體基質(zhì)或特殊基質(zhì)如溶血基質(zhì)或高血脂基質(zhì)考察選擇性。4精密度與準(zhǔn)確度應(yīng)選擇至少5個(gè)濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度以及方法總誤差考察。包括定量下限濃度、低濃度質(zhì)控定量下限濃度的3倍以內(nèi)、中濃度質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)曲線中段、高濃度質(zhì)控定量上限濃度75犯上以及定量上限濃度質(zhì)控。低、中、高濃度質(zhì)控標(biāo)示值不得與校正標(biāo)樣濃度標(biāo)示值相同，質(zhì)控樣品應(yīng)經(jīng)過(guò)冷凍，并與試驗(yàn)樣品采用相同的方法進(jìn)行處理。不建議采用新鮮配制的質(zhì)控樣品進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度考察。批問(wèn)考察應(yīng)在

29、數(shù)日內(nèi)進(jìn)行至少6個(gè)獨(dú)立的分析批測(cè)定。每批內(nèi)應(yīng)包含至少3套質(zhì)控樣品每套含至少5個(gè)濃度的質(zhì)控樣品。對(duì)于批內(nèi)和批問(wèn)準(zhǔn)確度，各濃度質(zhì)控樣品的平均濃度應(yīng)在標(biāo)示值的土20%定量下限和定量上限為土25%范圍內(nèi)。批內(nèi)和批問(wèn)精密度均不應(yīng)超過(guò)20%定量下限和定量上限為25%。止匕外，方法總誤差即相對(duì)偏差絕對(duì)值與變異系數(shù)之和不應(yīng)超過(guò)30%定量下限和定量上限為40%。5稀釋線性在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量范圍不能覆蓋預(yù)期樣品濃度的情況下，應(yīng)使用質(zhì)控樣品進(jìn)行方法的稀釋線性考察，即評(píng)價(jià)樣品濃度超過(guò)分析方法的定量上限時(shí)，用空白基質(zhì)將樣品濃度稀釋至定量范圍內(nèi)后，方法能否準(zhǔn)確測(cè)定。進(jìn)行稀釋實(shí)驗(yàn)的另一目的是考察方法是否存在“前帶”或“鉤狀”效

30、應(yīng)，即高濃度分析物引起的信號(hào)抑制。稀釋線性考察中，稀釋至定量范圍內(nèi)的每個(gè)QC羊品經(jīng)稀釋度校正后的回算濃度應(yīng)在標(biāo)示值的士20%圍內(nèi)，且所有QC羊品回算終濃度的精密度不超過(guò)20%6平行性為發(fā)現(xiàn)可能存在的基質(zhì)效應(yīng)，或代謝物的親和性差異，在可獲得真實(shí)試驗(yàn)樣品的情況下，應(yīng)考慮對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和系列稀釋的試驗(yàn)樣品之間進(jìn)行平行性考察。應(yīng)選取高濃度試驗(yàn)樣品最好采用超出定量上限的樣品，用空白基質(zhì)將其稀釋到至少3個(gè)不同濃度后進(jìn)行測(cè)定，系列稀釋樣品間的精密度不應(yīng)超過(guò)30%如果存在樣品稀釋非線性的情況即非平行性，則應(yīng)按事先的規(guī)定予以報(bào)告。如果在方法驗(yàn)證期間無(wú)法獲取真實(shí)試驗(yàn)樣品，則應(yīng)在獲得真實(shí)試驗(yàn)樣品后盡快進(jìn)行平行性考察。7

31、樣品穩(wěn)定性應(yīng)使用低、高濃度質(zhì)控樣品考察分析物的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考察應(yīng)包括室溫或樣品處理溫度下的短期穩(wěn)定性，以及凍一融穩(wěn)定性。止匕外，如果試驗(yàn)樣品需要長(zhǎng)期凍存，則應(yīng)在可能凍存樣品的每個(gè)溫度下進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。每一濃度質(zhì)控樣品應(yīng)有67%Z上的樣品濃度在標(biāo)示值的士20%圍內(nèi)。8商品化試劑盒商品化試劑盒可以用來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)樣品分析，但使用前必須按本指導(dǎo)原則的要求對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。2. 部分驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證在二、二和二、三中表達(dá)的關(guān)于驗(yàn)證的各項(xiàng)內(nèi)容都適用于配體結(jié)合分析。三試驗(yàn)樣品分析1. 分析批配體結(jié)合分析中最常使用微孔板，一個(gè)微孔板通常為一個(gè)分析批。每個(gè)微孔板應(yīng)包含一套獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品，以校準(zhǔn)板間差異。在使用某些平臺(tái)時(shí)，單個(gè)樣品載體的通量可能有限，此時(shí)允許一個(gè)分析批包含多個(gè)載體。可在該分析批的首個(gè)與末個(gè)載體各設(shè)置一套標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)在每一載體上設(shè)置質(zhì)控樣品。所有樣品均應(yīng)復(fù)孔測(cè)定。2. 試驗(yàn)樣品分析的接受標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于每個(gè)分析批，除錨定點(diǎn)外，標(biāo)準(zhǔn)曲線須有75%Z上的校正標(biāo)樣至少6個(gè)回算濃度在標(biāo)示值的20%定量下限和定量上限為土25%范圍內(nèi)。每塊板應(yīng)含有至少2套3水平低、中