土壤中放線菌的分離

1、土壤中放線菌的分離實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1 掌握配制合成培養(yǎng)基的一般方法。2 掌握稀釋倒平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。3 掌握平板劃線法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。4 掌握涂布平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)材料：藥品：可溶性淀粉、 KNO 3、NaCI、K2HPO 4?3H 2O、MgSO 4?7H 2O、FeSO4?7H2O、瓊脂。其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、試管、牛皮紙、硫 酸紙、線繩、無菌培養(yǎng)皿、鐵鍬、小鏟、酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。實(shí)驗(yàn)原理：高氏一號合成培養(yǎng)基是培養(yǎng)放線菌的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是采用化

2、學(xué)成分完全了解的純試劑配 制而成的培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO 3 、 NaCI 、 K2HPO 4?3H 2O 、MgSO 4?7H2O作為無機(jī)鹽，F(xiàn)eSO4?7H2O作為微生物的微量元素，提供鐵離子等組成。放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中，其數(shù)量僅次于細(xì)菌，一般在中性偏堿性、 有機(jī)質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體， 為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純 培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基 或有機(jī)氮培養(yǎng)基。

3、如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（1h1）0或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴 10% 酚等），都可以使細(xì)菌，霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過 稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨(dú)菌落，并可得到純菌株。實(shí)驗(yàn)步驟：1.高氏一號合成培養(yǎng)基的制備高氏一號瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）可溶性淀粉 20g ，硝酸鉀 1g, 氯化鈉 0.5g ，K2HPO4 ?3H2O 0.5g ，MgSO4 ?7H2O 0.5g ，F(xiàn)eSO4 ?7H2O O.OIg ，瓊脂 20g，水 1000ml , pH7.2 7.4。配制時(shí)，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶

4、化后，補(bǔ)足水分至 1000ml o 112 C滅菌20分鐘。2. 土壤中放線菌的分離（ 1 ）待測樣液的制備選定取樣點(diǎn)（最好是有機(jī)質(zhì)含量高的菜地） ，按對角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取 210cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無菌的。將 5點(diǎn)樣品 約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應(yīng)盡快投入實(shí)驗(yàn)。稱土樣 1g 于盛有 99mL 無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩 1020min ，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液，靜置 30s。另取裝有9ml無菌水的試管3支，編號10-3、10-4、10-5。用無

5、菌吸管無菌操作取 10-2濃度的土壤懸液1ml并加入編 號10-3的無菌試管中，并吹吸吸管 23次，使與9ml水混勻，即為10-3濃度的土壤稀釋液。依此 類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個(gè)稀釋度換 1支無菌吸管）。稀釋過程需在無菌室或無菌操作 條件下進(jìn)行。（ 2）稀釋倒平板法分離土壤中放線菌取 2支1 毫升移液管分別從 10-5、 10-4菌懸液中吸取 1 毫升菌懸液，分別注入編號 10-5、 10-4 的培養(yǎng)皿內(nèi)。將溫度為4550 C的高氏一號培養(yǎng)基倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28 C左右），每天觀察培養(yǎng)基表面有無微生物菌落。（ 3

6、 ）涂布平板法分離土壤中放線菌取2套無菌平皿，在皿底貼上標(biāo)簽，注明土壤稀釋液的稀釋度（10-4、10-5）、組別、姓名、操作日期等。每個(gè)稀釋度做一個(gè)培養(yǎng)皿。 然后在每皿中倒入已溶化并冷至 50 C左右的高氏一號培養(yǎng)基 1520ml左右，待冷凝成平板。用無菌吸管從濃度最小稀釋液開始，每次吸取0.1ml加到一組相應(yīng)編號（10-5）的高氏一號平板上（每次吸取前，吸管要在液體內(nèi)吹吸幾次），再依次將10-4的土壤稀釋液加到相應(yīng)平板上。用無菌刮棒（從濃度小的稀釋液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個(gè)平板表面涂勻。（4 ）平板劃線法分離土壤中放線菌取一培養(yǎng)皿置于實(shí)驗(yàn)臺上，左手將培養(yǎng)皿打開稍許，向培養(yǎng)皿

7、內(nèi)注入熔化的營養(yǎng)固體培養(yǎng)基1012毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使其中的培養(yǎng)基分布均 勻，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蠟筆劃分 A、 B、C、D幾個(gè)區(qū)。每組兩個(gè)平板培養(yǎng)基。1斜線法2曲線法3專格法4.放射法5”四格法轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70。角，用燒過冷卻的接種將培養(yǎng)皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在 火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在 火焰旁取少許10-2濃度的土壤稀釋液，迅速送入培養(yǎng)皿 內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線67條，針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成 30°角左右。不要使接種針碰到培

8、養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。（5）培養(yǎng)接種完畢，將平皿放入 28 C恒溫箱培養(yǎng)7天，觀察平皿上放線菌（主要是鏈霉菌）菌落。（6）挑菌落待三種方法的平板長出菌落后，鑒定微生物類群，并根據(jù)鏡檢結(jié)果，判斷是否已分離到了純菌 種。如果菌種很純，則可轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng)。轉(zhuǎn)種至斜面，菌種用牛皮紙包好，置C冰箱中保存。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：無菌刮棒打火機(jī)酒精燈無菌報(bào)紙包（1個(gè)） 99mL水/三角瓶（玻璃珠）5支移液管3支9mL水的試管培養(yǎng)皿6套槍頭（1mL/0.1mL ）高氏一號培養(yǎng)基 500mL （ 150mL三角瓶2個(gè)，200mL試管）思考題：1. 檢查接種后培養(yǎng)物的生長情況和染菌情況。2. 觀察與記錄以下內(nèi)容。大小 形狀 邊緣顏色表面代謝物種類3. 如何區(qū)分放線菌和真菌、細(xì)菌？放線菌菌落小而緊密、干燥、不透明、難以挑取，當(dāng)大量孢子覆蓋于菌落表面時(shí)，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落，由于基內(nèi)菌絲和孢子常有顏色，使得菌落的正反面呈現(xiàn)出不 同的色澤。霉菌菌落的話應(yīng)該是比較大的，可能是大而疏松也可能大而緊密，其他一些 跟放線菌都差不多，比如都是顏色多種