人工蟲草提取物對缺血心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制

1、人工蟲草提取物對缺血心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制作者：韓冰，王澤君，王天，李紫，張雷明，劉珂【關(guān)鍵詞】 人工蟲草菌絲；,缺血；,心??；,保護(hù)摘要：目的 研究 人工蟲草提取物對缺血心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支（LAD）造成急性心肌缺血模型，觀察人工蟲草水提取物（Water extract from cultural mycelium,WE）、醇提取物（Ethanal extract from cultural mycelium,EE）、醋酸乙酯提取物(Ethyl acetate extract from cultural mycelium,EA)和石油醚提取物（Petro

2、leum ether extract from cultural mycelium,PE）對心肌梗死面積（MIS）、血清磷酸肌酸肌酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）及超氧化物歧化酶（SOD）的 影響 。結(jié)果WE，EE和 PE可明顯減小MIS，降低CK-MB及LDH活性，減少M(fèi)DA含量，增高NO含量，提高NOS和SOD活性。結(jié)論 WE，EE和 PE對缺血心肌具有保護(hù)作用，其機(jī)制與WE，EE和 PE提高NOS和SOD活性從而擴(kuò)張冠狀動脈和抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。關(guān)鍵詞：人工蟲草菌絲； 缺血； 心??； 保護(hù)Abstract：Objective

3、To evaluate the effects of extracts from cultural mycelium of Cordyceps sinensis on myocardial infarction and explore the possible mechanisms involved in it. MethodsRats were treated with water extract from cultural mycelium（WE）,ethanal extract from cultural mycelium（EE）,ethyl acetate extract from c

4、ultural mycelium (EA) and petroleum ether extract from cultural mycelium（PE）for 7 days before myocardial infarction induced by coronary occlusion.Themyocardial infarct size(MIS), creatine phosphokinase(CKMB) activity, lactate dehydrogenase(LDH) activity, nitric oxide (NO) content, malondial dehyde(M

5、DA) content， nitric oxide synthase (NOS) and superoside dismutase (SOD) activity were measured.ResultsWE，EE and EA significantly reduced MIS, exerted notable inhibition in the elevation of CK-MB activity, LDH activity and MDA content, markedly increased NO level, NOS and SOD activities. ConclusionTh

6、e results indicated that WE, EE and EA showed a capacity to resist ischemic damage and the mechanisms were correlated with mediating NOS and SOD activity at least, in part.Key words：Cultural mycelium of Cordyceps sinensis; Ischemic; Cardiocytes; Protection冬蟲夏草Cordyceps sinensis是我國的傳統(tǒng)中藥，為麥角菌寄生在蝙蝠蛾幼蟲上

7、的干燥子座和蟲體，其性味甘平，具補(bǔ)肺益腎、止血化痰之功效。由于冬蟲夏草產(chǎn)地局限，產(chǎn)量稀少，現(xiàn)多用人工培養(yǎng)品，人工培養(yǎng)的冬蟲夏草稱為蟲草菌絲體或簡稱蟲草。冬蟲夏草富含多種氨基酸、多糖、有機(jī)酸、微量元素、核苷、肽類和甾醇等多種化學(xué)成分，藥理作用廣泛，對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等都有調(diào)節(jié)作用。近年來，有關(guān)蟲草對心血管系統(tǒng)作用的研究表明，蟲草有明顯降壓及負(fù)性頻率作用1，2；清除自由基作用3，4和抗心律失常作用5等，但有關(guān)人工蟲草提取物對心肌缺血損傷的影響尚未見報道。因此本文通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支造成急性心肌缺血模型，觀察了人工蟲草水提取物、醇提取物、醋酸乙酯提取物和石油醚提取物對缺血心

8、肌的影響并對其作用機(jī)制進(jìn)行了探討。1 器材1.1 動物Wistar大鼠，雄性，體重250 300 g，山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司實驗動物中心提供。合格證號200106005。1.2 藥品與試劑人工蟲草水提取物（WE）、醇提取物（EE）、乙酸乙酯提取物(EA)、石油醚提取物（PE）,由山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司提供；復(fù)方丹參片，山東省東營仙河制藥廠，批號030937；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT），上海前進(jìn)試劑廠；血清磷酸肌酸肌酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）及超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自南京建成生物工程公司。1.

9、3 儀器722E型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；TDL-40B 臺式離心機(jī)上海安亭 科學(xué) 儀器廠。2 方法2.1 動物分組與給藥70只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成7組，每組10只。分別為假手術(shù)組（Sham）、心肌缺血模型組（Model）、復(fù)方丹參組(DS) 、人工蟲草菌絲體水提取物組（WA）、醇提取物組（EE）、醋酸乙酯提取物組（EA）、石油醚提取物組（PE）。Sham 與Model給予羧甲基纖維素鈉100 mg/kg灌胃，DS，WA，EE，EA和PE分別給予復(fù)方丹參338 mg/kg，人工蟲草菌絲體水提取物12 mg/kg，醇提取物12 mg/kg，醋酸乙酯提取物12 mg/kg，石

10、油醚提取物12 mg/kg灌胃。灌胃1次/d，連續(xù)7 d。2.2 心肌缺血模型建立6末次給藥1 h后烏拉坦1 000 mg/kg ip麻醉大鼠，仰位固定于手術(shù)臺上，自左側(cè)34肋間開胸，暴露心臟，以0號線于肺動脈圓錐及左心耳間結(jié)扎冠狀動脈左前降支，將心臟送回胸腔，擠出胸腔內(nèi)血液和氣體，迅速關(guān)閉胸腔，開胸時間不超過30 s，假手術(shù)組僅置縫線而不結(jié)扎冠狀動脈。24 h后烏拉坦1 000 mg/kg ip麻醉大鼠，腹主動脈插管取血，離心（3 000 r/min，10 min）分離得血清樣品，按試劑盒操作說明測定血清中CK-MB，LDH，NOS，SOD活性及NO，MDA含量；取血后立即打開大鼠胸腔，剪取

11、心臟后用生理鹽水洗凈心腔內(nèi)積血，去掉心房組織及脂肪，稱重，將左心室心肌橫切4片，然后浸入0.1 % NBT磷酸緩沖液中，置37 恒溫水浴中15 min，待染色完全后取出，正常心肌組織染色，缺血心肌組織不染色。切下缺血心肌稱重，按下列公式 計算 心肌梗塞面積（MIS）MIS（%） = 缺血心肌重/左心室重100% 。2.3 統(tǒng)計學(xué) 分析 實驗數(shù)據(jù)以s表示，組間比較采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。3 結(jié)果3.1 人工蟲草提取物對MIS，CK-MB和LDH的 影響 與模型組比較，DS，WE，EE和PE均能顯著減小心肌梗塞面積（P0.01或P0.05），抑制血清CK-MB和LDH升高（P0.01或P0.05）

12、，但EA未見明顯抗心肌缺血作用。結(jié)果見表1。表1 人工蟲草提取物對MIS，CK-MB和LDH的影響（略）與假手術(shù)組比較，#P0.05,#P0.01；與模型組比較，*P0.05,*P0.01；n=103.2 人工蟲草提取物對SOD和MDA的影響與模型組比較，DS，WE，EE和PE均能顯著升高SOD活性（P0.05），降低MDA含量（P0.05）。結(jié)果見表2。表2 人工蟲草提取物對SOD和MDA的影響（略）與假手術(shù)組比較，#P0.05；與模型組比較，*P0.05；n=103.3 人工蟲草提取物對NOS和NO的影響與假手術(shù)組比較，模型組NOS和NO均未見明顯變化；與模型組比較，DS，WE，EE和PE

13、均能顯著升高NOS活性和NO含量（P0.01或 P0.05）。見表3。表3 人工蟲草提取物對NOS和NO的影響（略）與模型組比較，*P0.05,*P0.01； 與模型組比較，*P0.05, *P0.01；n=104 討論心肌缺血缺氧使細(xì)胞膜對Ca2+的通透性增高，Ca2+內(nèi)流增加，使胞漿Ca2+濃度增高。Ca2+增多可抑制線粒體功能，ATP生成減少而加重細(xì)胞損傷；可激活磷脂酶，使細(xì)胞膜磷脂分解；使溶酶體膜磷脂分解而釋放大量溶酶體酶，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞及其周圍組織溶解壞死。心肌缺血缺氧還通過交感神經(jīng)興奮和胞漿中Ca2+濃度增高等途徑產(chǎn)生大量活性氧和自由基，活性氧和自由基攻擊細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的不飽和脂肪酸，

14、引起脂質(zhì)過氧化，將脂質(zhì)降解為MDA等小分子7。心肌細(xì)胞內(nèi)富含與代謝相關(guān)的酶，如CK-MB和LDH等，心肌細(xì)胞損傷或壞死后，CK-MB和LDH等酶將滲透進(jìn)入血液。因此，血清中CK-MB和LDH的含量可反映心肌損傷和壞死的程度8。本實驗結(jié)果表明，WE、 EE和 PE可明顯減小MIS而且降低了血清中CK-MB和LDH的含量，這充分說明WE，EE和 PE對缺血心肌具有保護(hù)作用。為防御活性氧和自由基對組織細(xì)胞的損傷，機(jī)體存在清除各種活性氧和自由基的酶系統(tǒng)，如SOD、過氧化酶和谷胱甘肽過氧化酶等。其中SOD被視為活性氧和自由基的第一防線。WE，EE和 PE明顯升高了SOD活性，則使SOD清除活性氧和自由基

15、的能力增加，降低細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，使MDA產(chǎn)生減少，從而保護(hù)缺血的心肌細(xì)胞。血氧供需失衡和血栓形成是心肌缺血的重要病理生理機(jī)制，因此，改善心肌的血氧供需矛盾與抗血栓是 治療 心肌缺血的藥理基礎(chǔ)。NO由L-精氨酸在NOS作用下產(chǎn)生。NO通過激活細(xì)胞內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶使cGMP水平升高，從而產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括擴(kuò)張冠狀動脈，抑制白細(xì)胞和血小板黏附，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等9，10。本實驗結(jié)果表明：WE，EE和 PE增高NOS活性，進(jìn)而產(chǎn)生NO擴(kuò)張冠狀動脈等生物效應(yīng)，緩解心肌需氧與供氧的失衡，起到抗心肌缺血的作用。本 研究 通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈造成心肌缺血模型，證明WE， EE和PE對缺血心肌具有保護(hù)作

16、用，其機(jī)制與WE， EE和 PE抑制脂質(zhì)過氧化和擴(kuò)張冠狀動脈有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示EA不具有抗心肌缺血作用，那么EA與WE，EE和 PE的成分有何不同，WE，EE和 PE中究竟是哪種成分具有抗心肌缺血作用，WE，EE和 PE是否還通過其他途徑保護(hù)缺血心肌，這將是我們下一步深入研究和探討的 問題 。 參考文獻(xiàn) ：1 Liu C K. Recent progress in pharmacology of Cordyceps sinensis and Cultrual myceliumJ.山東中醫(yī)雜志,1991,10(5)：42.2 Lou Y Q, Liao X M, Lu Y C. Pharmco

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