人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

1、人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究         11-03-24 10:17:00     編輯：studa20                    作者：朱月蓉, 邢繼成, 韓萍, 邱紅【摘要】  目的：構(gòu)建含人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hHGF)基因的骨髓間

2、充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，獲得高表達(dá)hHGF的MSCs。方法： 構(gòu)建含hHGF基因的腺病毒表達(dá)載體pDC316HGFIRESEGFP。同源重組法獲得含hHGF的重組腺病毒AdHGF。以?xún)H表達(dá)GFP基因的重組腺病毒AdGFP為對(duì)照，體外分別以AdGFP, AdHGF感染MSCs。熒光激活細(xì)胞分選術(shù)檢測(cè)受染細(xì)胞的基因表達(dá)效率。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)上清中hHGF表達(dá)的濃度和持續(xù)時(shí)間。結(jié)果： 腺病毒表達(dá)載體經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶切后有2.2 kb的hHGF目的基因片段和5.2 kb的線性化載體片段；目的片段測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中hHGF cDNA序列一致。病毒液AdHGF純化后滴度可以達(dá)到8.02&#

3、215;1010 pfu/ml。FACS檢測(cè)HGF/MSCs的GFP陽(yáng)性率達(dá)95.19%。HGF/MSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清中hHGF能持續(xù)表達(dá)至少14 d；最高濃度達(dá)到99 ng/ml。結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)中腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建正確；重組腺病毒液AdHGF滴度高；轉(zhuǎn)導(dǎo)后在MSCs中獲得高效、穩(wěn)定和持續(xù)表達(dá)的hHGF。該載體達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，為進(jìn)一步的體內(nèi)外研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  間充質(zhì)干細(xì)胞; 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 腺病毒載體AbstractObjective: To construct the adenoviral expression vector system containing

4、 human HGF cDNA, and produce the virus containing hHGF, and to further study the transducing efficiency and the expression of HGF in MSCs.  Methods： The HGF cDNA was amplificated from the expression plasmid pCMVHGF by PCR，and subcloned into the same site of the plasmid pDC316IRESEGFP vector.

5、60; The recombinants, named pDC316HGFIRESEGFP, were identificated with restriction enzyme digestion and sequencing.  Then we produced virus AdHGF and AdGFP by homologous recombination in HEK293 package cells.   BMMSCs were transduced with AdHGF， and HGF/MSCs were generated.  The

6、efficiency of AdHGF transduction was assessed by FACS analysis.  The HGF concentrations in supernatants of HGF/MSCs were determined by ELISA.  Results： The recombinants pDC316HGFIRESEGFP contained fragments of hHGF.  The DNA sequencing of HGF was identical to the report in Genbank.

7、60; After packing of the pDC316HGFIRESEGFP in HEK293 cells, 8.02×1010 pfu/ml titer of AdHGF was obtained.  Fortyeight hours after transduction, 95.19% of HGF/MSCs were GFP positive， and peak concentration levels of hHGF in the cultured supernatants were detected.  The adenovirusmediat

8、ed expression of HGF by MSCs was maintained for at least 2 weeks in vivo.   Conclusion： Our data demonstrated that the adenoviral expression vector system pDC316HGFIRESEGFP containing hHGF cDNA had been constructed correctly, and its effective expression also had been obtained in MSCs.

9、0; It will provide material basis for the next study.Key wordsmesenchymal stem cells;  hepatocyte growth factor;  adenoviral expression vector   間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在與肝細(xì)胞體外共培養(yǎng)時(shí)，有促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；在特定條件下，能分化為肝臟細(xì)胞。將其移植到體內(nèi)也能促進(jìn)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)損傷的肝臟盡快恢復(fù)1。同時(shí)MSCs是攜帶外源基因的良好載體。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）是目前公認(rèn)最強(qiáng)的肝臟再生劑，通過(guò)

10、多種途徑發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用：促進(jìn)肝細(xì)胞再生，改善肝功能和減輕肝損害，在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中被廣泛應(yīng)用2。在體外，HGF是干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的最關(guān)鍵細(xì)胞因子。在體內(nèi)，HGF能促進(jìn)活化的肝臟干細(xì)胞遷移至肝實(shí)質(zhì)，這些干細(xì)胞在肝內(nèi)定植并進(jìn)一步分化為肝細(xì)胞3。    本研究旨在構(gòu)建高表達(dá)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hHGF）的MSCs（HGF/MSCs），為下一步用HGF/MSCs治療肝硬化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。    1  材料和方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料含人全長(zhǎng)HGF基因的質(zhì)粒pCMVHGF由南京醫(yī)科大學(xué)第

11、一附屬醫(yī)院肝臟外科俞悅博士惠贈(zèng)。腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC316IRESEGFP、骨架質(zhì)粒pBHGloxE1 3Cre及其包裝系統(tǒng)AdMaxTM購(gòu)自北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染用試劑Lipofectamine購(gòu)自Invitrogen生物技術(shù)公司；小鼠抗大鼠CD34單克隆抗體：美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；小鼠抗大鼠CD90，CD11b/c, CD29單克隆抗體：美國(guó)BioLegend公司；小鼠抗大鼠CD45，CD54單克隆抗體，小鼠IgG1 kappa單克隆抗體：美國(guó)Catag Laboratories公司；成年Lewis大鼠(雌雄不限，體質(zhì)量180230 g)

12、，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。    1.2  實(shí)驗(yàn)方法無(wú)菌條件下分離Lewis大鼠股骨、脛骨，去除軟組織，切除股骨兩端，用含肝素(20 U/ml)的PBS液沖出骨髓，輕輕混勻，使充分散開(kāi)；利用密度梯度離心法分離MSCs。獲取單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml后，25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)、傳代。整個(gè)實(shí)驗(yàn)選用36代細(xì)胞，以確保MSCs的純一性和未分化性。    MSCs可表達(dá)多種表面抗原MSCs5,我們選取CD34,CD29,CD45,CD11b/c,CD90,CD54作為其鑒定標(biāo)記。被測(cè)細(xì)胞濃

13、度用含1%FBS的PBS緩沖液調(diào)節(jié)至（0.51）×106/ml，吸取50 l標(biāo)本，加入單克隆抗體10  l，室溫下與相應(yīng)單抗避光孵育20 min。PBS洗2遍后加入0.5 ml PBS將細(xì)胞打勻，應(yīng)用FACS檢測(cè)BMMSCs表面標(biāo)志。用抗小鼠IgG1FITC,IgG1PE標(biāo)記的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，每次分析2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。設(shè)計(jì)帶上游AgeI、下游帶入NheI的引物，以pCMVHGF為模板保真擴(kuò)增HGF基因。引物序列如下：HGFAgeIF：5TAAACTATACCGGTATGTGGGTGACCAAACTC3；HGFNheIR：5TAAACTATGCTAGCCTATGACTGTGGTA

14、CCTT3。PCR產(chǎn)物用AgeINheI雙酶切，酶切后回收約2 kb的片段，此為片段(1)。AgeINheI雙酶切pDC316IRESEGFP質(zhì)粒，回收約5 kb的大片段，此為片段(2)。連接片段(1)、(2)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5細(xì)胞，篩選及小提質(zhì)粒后，再用AgeINheI雙酶切，并經(jīng)測(cè)序鑒定，獲得重組子pDC316HGFIRESEGFP。采用細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組法：將HEK293細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5×105細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h后，取骨架質(zhì)粒（4 g）和穿梭質(zhì)粒pDC316HGFIRESEGFP（1 g），用LipofectAMINE脂質(zhì)體按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。獲得第1代毒種

15、，作為隨后大量病毒擴(kuò)增的毒種。    在HGF基因的中間部位設(shè)計(jì)鑒定引物，引物序列為：HGFF：5GCCAGAGCTCATGTGGGTGAC3,HGFR：5CTGCGTCGACCTGAGGAATGTC3。擴(kuò)增長(zhǎng)度為600 bp。取50 l毒種上清液，進(jìn)行PCR鑒定，檢測(cè)重組腺病毒中是否插入目的基因hHGF。重組腺病毒毒種擴(kuò)增與純化后，用經(jīng)典方法測(cè)定病毒制品的TCID50值，分裝保存于-70 冰箱中。實(shí)驗(yàn)分為3組：轉(zhuǎn)染AdHGF的實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染AdGFP空載體的陰性對(duì)照組，不加病毒的空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)導(dǎo)前24 h，收獲MSCs細(xì)胞，以3×105個(gè)/孔的密度接種于

16、6孔板中。轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)吸去培養(yǎng)基，加入5 ml培養(yǎng)基（含AdHGF或AdGFP 100 l），CO2孵箱培養(yǎng)6 h后補(bǔ)液至10 ml。72 h 后，按13 傳代。用FACS檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞GFP表達(dá)，判斷HGF基因的轉(zhuǎn)染效率。MSCs經(jīng)AdHGF，AdGFP轉(zhuǎn)染后，所得細(xì)胞分別命名為HGF/MSCs，GFP/MSCs。收集不同時(shí)間點(diǎn)（0,2,4,6,8,10,12,14天）的細(xì)胞培養(yǎng)上清，以MSCs為空白對(duì)照，檢測(cè)其中hHGF濃度。    2  結(jié)果    2.1  MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定  

17、0; FACS結(jié)果證實(shí)我們分離培養(yǎng)的6代以?xún)?nèi)細(xì)胞均只表達(dá)CD29,CD54,CD90，而造血干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞各自特異性表達(dá)的標(biāo)記CD34,CD45,CD11b/c均呈陰性表達(dá)。這群細(xì)胞特性穩(wěn)定，擴(kuò)增一代和兩代后的細(xì)胞同質(zhì)性分別達(dá)到96.18%,93.59%和98.63%(圖1)。2.2  穿梭質(zhì)粒pDC316HGFIRESEGFP的鑒定結(jié)果    pDC316HGFIRESEGFP經(jīng)AgeINheI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)一大小約2.2 kb的DNA片段（圖2a），與hHGF基因大小一致，表明目的基因已成功克隆至穿梭質(zhì)粒pDC316HGFIRESEGFP中。將鑒定正