化學發(fā)光法測試模式相關結果小結

1、基于磁分離的化學發(fā)光發(fā)測定試劑的項目設計及初步進展2008年1月一、 項目設計背景1.國際成熟的免疫學自動檢測體系及分析早在上世紀八十年代，一些知名的IVD廠商就開始全自動免疫分析儀的研制。發(fā)展到今天，市場上的全自動免疫分析儀已經非常成熟，而檢測原理也有著一定的區(qū)別。對此，我們做一個簡單的分析。Abbott公司，第一代產品也是目前世界上臨床應用最為成功的全自動免疫分析儀，Axsystem,檢測原理是：基于聚苯乙烯粒子包被，堿性磷酸酶標記(Alp)的熒光分析技術，儀器的洗滌體系為其專利的醋酸纖維吸附洗滌，洗滌及檢測杯設計得非常精致，科學，保證了檢測體系的特異性和精密性，因此在國內，很長一段時間里

2、，Axsystem的檢測結果都作為一些項目檢測的金標準。但是由于體系的檢測信號為熒光信號，因此其檢測量程相對較低，例如：CEA檢測高限最高為500ng；從而影響了項目的檢測性能。第二代產品Architect系列是基于磁珠包被的，吖啶酯標記的化學發(fā)光免疫學檢測分析儀。該體系采用磁珠分離體系，吖啶酯標記的化學發(fā)光技術，吖啶酯作為化學發(fā)光法標記物，優(yōu)點很多：首先縮短了檢測光信號所需要的時間，其次發(fā)光集團能夠在強堿的作用下脫落，之后在均勻的液相中收集光信號，使體系可能擁有更好的精密度，同時光信號的采集是對整個峰值的積分，使檢測體系擁有更廣的檢測量程，例如：CA125在該體系的檢測高限可達1500ng，

3、是Axsystem的3倍。但吖啶酯標記的化學發(fā)光技術為Bayer公司的專利，在應用上存在限制。Bayer公司（Siemens），全自動免疫檢測分析體系實際是來自Ciba-corning檢測體系，即：吖啶酯標記，磁珠捕獲的化學發(fā)光檢測體系。該體系同Architect體系一樣，應用吖啶酯有專利的限制。BeckmenCoulter公司,堿性磷酸酶標記，磁珠捕獲的化學發(fā)光檢測體系，堿性磷酸酶標記的缺點很多：首先，作為標記物，分子量過大，在免疫學反應過程中可能存在空間位阻從而影響捕獲，其次人血清中含有堿性磷酸酶的同工酶，可能存在由于非特異性吸附造成的非特異性發(fā)光反應。但是，相對于吖啶酯標記，堿性磷酸酶沒

4、有專利限制，標記技術成熟，發(fā)光反應與標記物濃度之間有著良好的信號相應關系。Johnson&Johnson，HRP標記，管式捕獲，該體系基本是在HRP酶標記顯色的基礎上略作改進，采用HRP標記技術，標記技術成熟，市場上應用時間長，整個標記體系在市場上已經非常成熟，但該體系缺點很多，管式捕獲，包被流程復雜，工藝要求高，同時管間精密度也比較難控制，HRP的化學發(fā)光體系，由于整個反應非常復雜，因此，發(fā)光信號和標記物之間相應關系較差，即：發(fā)光信號與標記物濃度之間沒有很好的比例關系，從而影響檢出靈敏度和量程；從這點而言并不適合做量程要求較高的定量檢測。Roche，以專利的電化學檢測在整個免疫學檢測

5、體系中獨樹一幟，優(yōu)點很多，靈敏度高，量程廣，但缺點也有，但由于有專利限制，也影響了其應用。二、 項目設計依據(jù)1.為什么選擇化學發(fā)光？免疫學檢測(immunoassay)是一類以抗原抗體之間發(fā)生的免疫學反應為基礎的檢測。根據(jù)檢測過程中的最終檢測信號的不同，可以分為：放免、可見光檢測（optical detection）如比色類及以酶聯(lián)免疫吸附為代表的吸光度檢測（absorbance），光發(fā)射類（emission）主要是熒光、化學發(fā)光信號的檢測。上述這幾大類的檢測中以可見光類的檢測靈敏度最低，但由于對儀器依賴較小，檢測方法成熟，收費較低，因此，在我國的廣大地區(qū)有著廣泛的應用；但由于測定主要以定性測

6、試為主，并且靈敏度較低，量程只有20倍左右，因此可以檢測的項目非常有限，這也限制了這種方法在臨床中的應用。光發(fā)射類主要有熒光和化學發(fā)光類。熒光類的信號檢測包括前幾年炒作非常熱的時間分辨熒光檢測，用于小分子檢測的能量傳遞類檢測等；相對于可見光類信號檢測，熒光信號的檢測靈敏度高，量程可達103左右，但熒光信號的檢測受到多種因素的干擾，如標本的生物學本底，激發(fā)光波長和發(fā)射波長之間的狹窄的斯托頓位移等，都將影響檢測的特異性，進而降低了檢測的實際靈敏度和量程；同時儀器檢測成本非常高（激發(fā)波長需要488nm的激光器），似乎更適合于多相檢測。相對于其他方法，化學發(fā)光類的信號類檢測靈敏度最高，檢測的理論量程可

7、達105左右，但實際不同的發(fā)光體系檢測靈敏度略有差異，檢測量程的差別也非常大?；瘜W發(fā)光類免疫學檢測按標記物進行分類，可分為酶促化學發(fā)光免疫學檢測和化學發(fā)光標記免疫學檢測?；瘜W發(fā)光標記應用的最廣的標記物主要是吖啶酯類，這是一種比較理想的標記物，但由于存在嚴格的專利保護，因此我們基本不存在應用的可能性。酶促化學發(fā)光標記物主要有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（Alp），一般認為Alp靈敏度高于HRP，但實際上，不同的底物體系的實際檢測靈敏度差異很大，而不同的檢測體系實際檢測量程也差別很大。本實驗室測試結果顯示，在同一檢測體系中，已篩選出的靈敏度最佳的HRP底物體系和 Alp底物體系相比，Alp

8、體系的量程和檢出靈敏度均優(yōu)于HRP，并且Alp體系發(fā)光信號非常穩(wěn)定，因此，就發(fā)光體系本身而言，Alp體系確實優(yōu)于HRP。但是Alp的應用在免疫學檢測中，存在很多其他問題，如：交聯(lián)，人血清標本中內源性Alp的干擾問題等等，都限制了Alp在臨床中的應用。2.為什么是磁珠？免疫學檢測按檢測方式來分有均相和非均相。前者由于沒有洗滌過程，抗干擾性非常弱，因此，目前不是免疫學檢測的主流。非均相檢測又可分為基于聚苯乙烯板包被的固相反應和基于粒子（聚苯乙烯粒子或磁性粒子）包被的液相反應。相對于固相反應，液相反應優(yōu)點很多，在標記物相同的情況下，液相反應有更寬的檢測量程。并且，對于磁珠來說，易于洗滌，理論上檢測試

9、劑可能有更好的精密度。對于制備工藝來說，采用磁珠進行包被，生產工藝簡單，生產過程的人員設備成本非常低，生產流程易于控制，容易規(guī)?；?。3.為什么是自動化的免疫分析體系？首先，發(fā)光法檢測本身非常容易受到環(huán)境因素的影響，因此，需要較為封閉的檢測體系，而酶促化學發(fā)光，對檢測體系還有溫控的要求，磁珠的洗滌也需要相應的配套儀器，所有這些要求，如果分拆成手工操作，將增加其不精密度和測定時的不準確度，從而削減方法學本身的優(yōu)勢；同時，手工法的測定模式從長遠來看，應該會慢慢退出中高端的醫(yī)院市場。其次，自動化的免疫分析體系的研制成功，將使我們有可能為醫(yī)院提供模塊式小型工作站的服務模式。根據(jù)市場上各大IVD廠商推出的

10、儀器系列，我們很清楚的看到，整合已經是將來的發(fā)展趨勢，如Roche公司提供的免疫測試模塊和生化測試模塊，使得用戶能夠根據(jù)測試量的大小來自行整合，從而對實驗室的檢測資源進行優(yōu)化。我們公司已經擁有全自動的生化分析儀，配合全自動的免疫分析儀，將使我們的檢測系統(tǒng)更具有競爭力；從而使我們的產品在未來很長一段時間內，能夠立于不敗之地。三、 項目設計方案基于上述分析，我們對于化學發(fā)光免疫學檢測系列試劑的開發(fā)的定位為基于磁珠包被的酶促化學發(fā)光全自動免疫分析體系。項目具體設計如下：1. 第一階段：檢測模式的確定，由于現(xiàn)有的應用于免疫學檢測的方法主要有：夾心法和競爭法。因此，確定整個檢測流程及檢測模式時，應包含這

11、兩種檢測方法的通用模式。2. 第二階段：完成部分目前醫(yī)院里最具市場的項目開設及基本性能考核；同時，儀器開發(fā)能基本確定加樣體系，洗滌體系及檢測體系，初步確定儀器開發(fā)方案并完成簡易的儀器測試；3. 第三階段：完成所有開設項目的基本性能考核，儀器開發(fā)完成。4. 第四階段：完成所有項目溯源性考核，性能考核，臨床考核，開始項目申報。 5. 第五階段：完成市場后完善，開設新的項目。四、檢測模式的確定通過對市場上現(xiàn)有免疫學化學發(fā)光檢測模式的篩選，計劃采用以鏈霉親和素包被的磁珠（SAMag）為固相捕獲載體，以辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶作為標記物的化學發(fā)光檢測模式。目前我們已經獲得如下結果：1. 不同臂長生物素

12、比較由于空間位阻對SAMag的捕獲效應有一定影響，因此，考核不同臂長的生物素對測定結果的影響。通過對不同臂長的生物素的考核，確定最佳臂長的生物素，用作進一步的測試。2. 不同粒徑SAMag的篩選由于磁珠粒徑的大小決定了單位體積內SA的含量，也決定了單位體積的磁珠的捕獲能力，一般來說，粒徑越小則單位體積的SA含量越高，磁珠的捕獲力越強；但同時粒徑越小，磁珠在多次洗滌轉移中的損失也較大（上吸法分離磁珠），經過測試及綜合評估，最終選出合適粒徑的磁珠作為固相捕獲載體。3.HRP及Alp發(fā)光底物的篩選采用通用模式對來自不同供應商的底物進行檢測分析。即HRP/Alp和Biotin進行交聯(lián)，分別用SA包被的

13、磁珠和SA包被的發(fā)光板考核現(xiàn)有的HRP/Alp發(fā)光底物，現(xiàn)有各底物體系中，測定結果初步表明，底物是化學發(fā)光系統(tǒng)的決定因素。HRP現(xiàn)有底物的靈敏度在本系統(tǒng)的測試為50pg/ml,量程在103左右；Alp底物檢測靈敏度在5 pg/ml，量程在104左右，相對光子數(shù)與Alp濃度之間有著良好的響應關系。4.Alp交聯(lián)方法確定通過對Alp兩種交聯(lián)方法比較，最終選擇過碘酸鈉法對Alp進行抗體交聯(lián)。5.HRP與Alp兩種標記物發(fā)光法測定比較選用CA125作為待測物，對兩種酶促化學發(fā)光法做比較，分別對靈敏度，量程，信號與濃度之間的響應關系進行測試比較，最后確定采用Alp作為酶標記物，作進一步的測試。五、相關項

14、目測試結果1.按照上述測定模式，已經完成CA125，CEA，AFP，PSA，fPSA等腫瘤標志物的抗體配對工作。并完成相關項目性能指標的測試。2.甲狀腺素類測試甲狀腺素類主要打算開設三個項目：總T3，總T4和TSH。目前已完成總T4的體系構建及性能考核。總T3測試正在進行中。部分項目性能初步考核結果如下：CA125 （IU/ml）總T4（ng/ml）靈敏度不高于1.0不高于15線性范圍1.0500015350準確度良好良好特異性篩選400例獻血員血漿，特異性良好測試部分獻血員血漿，特異性良好3、穩(wěn)定性測試完成CA125及總T4Alp酶接物工作液373天熱穩(wěn)定性考核，測試結果良好，完成腫瘤標志物類Biotin抗體復合物工作液熱穩(wěn)定性考核，結果良好。目前，測試結果顯示，已基本Alp酶促發(fā)光的測試平臺的構建，完成上述七個產品（CA125，CEA，AFP，PSA，fPSA，總T4，總T3）的校準體系及質控體系的篩選和相關穩(wěn)定性測試。而進一步的性能考核及抗干擾性，校準品的溯源性測試，臨床考核等都需要儀器，才能完成。六、 最終測試流程總結根據(jù)上述測試結果，現(xiàn)有兩種測試模式：1.夾心法；2.競爭法?；竞w了現(xiàn)有的免疫學檢測項目的測試模式。夾心法測試流程如下：生物素化抗體樣本酶接物 3730min 加入鏈霉親和素磁珠 3730min 加入發(fā)光底物 測試讀數(shù)競爭法測試