實時熒光定量PCR技術的實驗研究

1、實時熒光定量PCR技術的實驗研究        摘要 實時熒光定量PCR技術是在普通PCR定性技術基礎上起來的核酸定量技術,已廣泛應用于不同研究領域。論述了熒光定量PCR技術的基本原理、主要類型和定量實驗方法,探討了實驗條件的控制、影響因素和優(yōu)化實驗結果的方法。 關鍵詞 熒光定量PCR技術;原理;主要類型;定量方法;優(yōu)化 Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR is a new kind of nucleic acid quantitative techniq

2、ue,which develops in the PCR qualitative technique base. It has been widely used in different research fields. In the paper,the experiment principles,the main types and quantitative methods of this technology were described. The control of experimental conditions,affecting factors and optimization o

3、f experimental results were discussed. Key words real-time fluorescent quantitative PCR;principle;main types;quantitative method;optimizing 實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍,而且具有靈敏度高、特異性和可靠性強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點1。目前,該技術已廣泛應用于分子生物學、醫(yī)學等學科和基礎研究領域,特別是在農業(yè)轉基因作物的定性

4、檢測、品系鑒定、轉基因成分含量的檢測中發(fā)揮著重要作用2。 1 熒光定量PCR技術的原理 熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法3。由于常規(guī)PCR無法對擴增反應進行實時檢測,需借助凝膠電泳等手段對擴增終產物進行定性和半定量分析,不僅費時、費事、易污染,且無法對起始模板準確定量。熒光定量PCR技術是在反應體系中加入熒光基團,熒光基團發(fā)出的熒光信號隨著反應進程而變化,每經過一個PCR循環(huán)反應,定量PCR儀收集1個熒光強度信號,通過熒光強度變化檢測產物量的變化,從而得到1條熒光擴增曲線,熒光擴增曲線一般由

5、基線、指數擴增期和平臺期組成4。只有在熒光信號指數擴增階段,PCR產物熒光信號的對數值與起始模板量之間存在線性對應關系,才可以在這個階段進行定量分析。為了便于對所檢測樣本進行比較,在熒光定量PCR 反應的指數期,需要設定1個熒光信號的閾值(threshold)。熒光閾值是熒光擴增曲線上人為設定的一個值,熒光閾值的缺省設置是315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍,用它可以定義樣本的循環(huán)閾值(Cycle Threshold,Ct)。Ct值是PCR擴增過程中,反應管的熒光信號達到設定閾值時的循環(huán)次數。可見,Ct值取決于閾值。經數學證明5,每個模板起始拷貝數的對數與Ct值存在線性關系。起始拷貝數越多

6、,Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上出該樣品的起始拷貝數6。 2 熒光定量PCR技術的主要類型 熒光定量PCR所使用的熒光化學材料可分為兩大類,即熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR Green為主要代表,是非特異性熒光化學材料。熒光探針包括TaqMan、分子信標、熒光標記引物、雜交探針等,屬于特異性熒光材料。 2.1 SYBR Green SYBR Green是一種能夠與雙鏈DNA小溝結合的染料。在游離狀態(tài)下,SYBR Green發(fā)出微弱的熒光,但是一旦與雙鏈DNA結合,其熒光強度大大增強。因此,一個反應發(fā)出的全部熒光信號與出現

7、的雙鏈DNA量成正比,可以根據熒光信號檢測出PCR體系中的雙鏈DNA的數量7。其優(yōu)點是檢測方法簡單,通用性好,價格相對較低,是許多實驗室開展熒光定量實驗的首選。SYBR Green的缺點在于它能夠和所有的雙鏈DNA相結合,因此由引物二聚體、單鏈二級結構、非特異性擴增產物引起的熒光信號會影響定量的準確性。但可以通過優(yōu)化PCR的反應條件、選擇設計良好的引物,來減少或去除引物二聚體和非特異性產物的產生;另外,也可以通過對擴增產物的溶解曲線進行分析來判斷熒光信號的真實性。 2.2 TaqMan探針 TaqMan探針技術是有美國Perkin Elmer(PE)公司研制的一種實時PCR定量技術,在PCR擴

8、增加入一對引物的同時加入1個特異性的熒光探針,此熒光探針為一個3045 bp的寡核苷酸,它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對,其5端標記熒光發(fā)射基團,3端標記熒光淬滅基團。當探針保持完整時,3端淬滅基團抑制了5端發(fā)射基團的熒光發(fā)射。但在PCR擴增中,模板變性后低溫退火,引物與探針同時與模板結合,在引物的介導下,沿模板向前延伸至探針結合處,發(fā)生鏈的置換,Taq DNA聚合酶的53外切酶活性將探針5端連接的熒光發(fā)射基團從探針上切割下來,游離于反應體系中,從而脫離3'端熒光淬滅基團的屏蔽,接受光刺激發(fā)出熒光信號。由于被釋放的熒光基團數目和PCR 產物數量是相對應關系,且熒光強度

9、同被釋放的熒光基團的數目也是正比關系,因此該技術可對模板進行準確定量8。TaqMan探針技術特異性好、準確性高、假陽性低、重復性比較好。但是需要設計特異性的探針,因此成本較高9。 2.3 分子信標 分子信標技術是一種呈發(fā)夾結構的莖環(huán)狀雙標記寡核苷酸探針,環(huán)部與靶DNA序列互補,為1535 bp;莖部是由互相配對的堿基組成,但與靶DNA無序列同源性,約8 bp。在探針的5端和3端分別標記熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團。當溶液中的模板與分子信標結合配對時,分子信標的構象改變成鏈狀使得熒光發(fā)射基團與淬滅基團分開,當熒光基團被激發(fā)時,就發(fā)出熒光信號。與探針互補的靶分子數量越多,熒光信號也就越強,從而實現了

10、對目的基因的定量檢測。分子信標的方法優(yōu)點是特異性強,熒光背景低。其缺點是設計困難,雜交探針不能完全與模板結合,穩(wěn)定性較差,價格高10。 1            3 熒光定量PCR技術的定量方法 實時熒光定量PCR技術是DNA定量技術的一次飛躍。運用該技術,可以對DNA、RNA樣品進行定量和定性分析。定量方法包括絕對定量和相對定量。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數和濃度;后者可以對不同方式處理的2個樣本中的基因表達水平進行比較。 3.1 標準曲線法的絕對定量法 用一系列已知

11、濃度的標準品,作為模板進行PCR反應,以標準品濃度的對數值為橫坐標,以測得的Ct值為縱坐標,繪制標準曲線,在相同條件下檢測未知樣品的Ct值,從而根據標準曲線出未知樣品的濃度(拷貝數)。制作1個好的標準曲線對定量結果至關重要,在制作標準曲線時,應至少選擇5個稀釋度的標準品,涵蓋待測樣本中目的基因量可能出現的全部濃度范圍,最好與目的基因有較高的同源性;絕對定量標準品通?？梢允羌兓馁|粒dsDNA,體外轉錄的RNA,或者是體外合成的ssDNA、標準品的量可根據260 nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量轉換成其拷貝數來確定。 3.2 雙標準曲線法的相對定量法 在某些不需要對基因進行絕對定量、只需

12、要確定基因相對表達差異的情況下,如某基因在經過某種處理后表達量是增加了還是減少了,用相對定量的方法就可以得到結果。雙標準曲線法是指在測定目的基因的同時測定某一內源性管家基因,并用目的基因和管家基因的標準品分別作出標準曲線,處理與未處理樣品同時擴增目的基因和管家基因,獲得Ct值,然后從各自的標準曲線上求出初始模板量,經管家基因均一化處理后,求出目的基因的相對含量。定量的表達是相對于某個參照物的量而言的,因此相對定量的標準曲線就比較容易制備,對所用的標準品不需要知道絕對拷貝數,只要知道其相對稀釋度即可。通常選用的管家基因有GAPDH、-actin、2-微球蛋白和rRNA。此方法在擴增效率較低、目標

13、基因與管家基因擴增效率有差異時適用,且需要很精確的結果計算。 3.3 比較Ct法的相對定量法 如果反應條件控制較好,擴增效率較高,目的基因和管家基因的擴增效率基本一致,這時就不需要作標準曲線,而是通過與管家基因Ct值之間的相差來計算目的基因的表達差異。比較Ct法運用了數學公式來計算相對量,前提是假設每個循環(huán)增加1倍的產物量,根據數學推導得出: 目的基因的量=2-C t 在該公式中,Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。因此,2-C t表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數,使用這一方法可以直接得到的目的基因相對于管家基因的定量,而不必制作

14、標準曲線11。 4 熒光定量PCR技術實驗條件的優(yōu)化 定量PCR技術已經在生物學研究中得到了廣泛的應用,技術也日臻完善,并且敏感度極高,特異性強;正因為敏感度高,很容易受其他因素的影響,因此要得到準確可靠的反應結果,必須根據不同的反應類型優(yōu)化實驗條件,如特異性探針及引物的設計、選擇合適的Mg2+濃度、引物和探針濃度、循環(huán)數等,規(guī)范操作步驟,并仔細配制PCR反應體系。 4.1 引物及探針 一是設計要求。引物設計是實時定量PCR中最重要的一步,擴增片段長度根據技術的不同有所區(qū)別:SYBR greenI技術要求擴增片段不大于500 bp,Taq Man探針技術要求擴增片段長度在50150 bp。引物

15、序列選取應在基因的保守區(qū)段并具有特異性,長度一般為1824 bp,避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對,引物自身不能形成環(huán)狀發(fā)卡結構,熔解溫度Tm值在5565 ,GC含量在40%60%,上、下游引物之間的Tm值相差不要超過4 。在Taqman探針的設計上要求絕對保守,長度為3045 bp,Tm值在6870 ,探針的5端不能為G和避免多個堿基同時出現,探針應盡可能靠近上游引物。二是濃度。引物和探針的濃度也會影響反應的特異性,引物濃度太低會致使反應不完全,引物濃度太高會導致非特異性產物擴增。最佳的引物濃度一般在0.10.6 moL/L,探針的濃度在0.050.30 moL/L,可以在

16、這個基礎上再進一步優(yōu)化,以達到引物探針整體的最佳濃度。三是穩(wěn)定性。一般從生物技術公司定制引物是以干粉形式運輸的,使用時最好用TE溶液溶解,使其最終濃度為100 moL/L,-20 保存。純度高、標記效率高的探針不僅熒光值高,且保存時間可以長達1年以上。由于反復凍融易導致探針降解,在確認探針質量好的情況下,最好稀釋成2 moL/L(10×),作為工作濃度分裝多支,避光保存。四是退火溫度。退火溫度一般設定比引物的Tm值低5。在理想狀態(tài)下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火;同時還要足夠高,以減少非特異性結合。合理的退火溫度一般為5570 。 4.2 模板質量與濃度 模板的質量會

17、影響PCR擴增的效率。模板應在-20 保存,避免反復凍融。用TE溶液溶解和稀釋模板,這能大大延長保質期。模板濃度應根據Ct值選擇,使Ct值位于1530個循環(huán)比較合適,若Ct值大于30,則應提高的模板濃度;如果小于15,則應降低的模板濃度。 4.3 鎂離子濃度 Mg2+是影響Taq酶活性的關鍵因素。Mg2+的濃度過高,會增加非特異性擴增,降低忠實性;Mg2+的濃度過低影響Taq酶發(fā)揮最佳活性。一般來說,對以DNA或cDNA為模板的PCR反應,應選擇25 mmoL/L濃度的Mg2+。 4.4 循環(huán)數 一般的實時定量PCR反應只需2530個循環(huán)便可獲得滿意的結果,但是對于那些極微量的待測樣本而言,適

18、當增加循環(huán)數可以提高反應的檢出底限,建議循環(huán)數為40個,但是并非循環(huán)數增加的越多,其敏感性就會越高。實際上,當循環(huán)數增加到某一值時,敏感性便不再升高。 4.5 重復實驗和陰性、陽性對照 定量實驗,誤差是不可避免的,設立重復實驗,對數據進行統(tǒng)計處理,可以將誤差降低到最小,因此定量實驗的每個樣本至少要重復3次以上。為了增加PCR擴增反應的可信度,在擴增的同時,需進行陰性、陽性對照反應。陰性反應中不加模板DNA,而以水或緩沖液代替,用于檢驗是否存在PCR污染。陽性對照則用于檢驗PCR試劑和實驗操作上可能出現的問題。相對來說,儀器、PCR 試劑、SYBR Green染料是很穩(wěn)定的,而操作和模板是薄弱環(huán)

19、節(jié),模板的加入量一定要準確,為確保實驗數據的有效性,每個樣品至少平行做3次重復。使用微量移液器時,如果不仔細,就會產生較大的用量誤差甚至錯誤。在實驗過程中應當避免室溫下混合各種試劑,應在冰上進行,避免所配體系產生氣泡,并且在一經混合后立即開始進行擴增。 5 結語 通過設計針對目的基因的特異性引物和探針,并優(yōu)化反應體系和控制反應條件,可以成功地建立快速、靈敏、特異的熒光定量PCR檢測方法,實現大樣本同時檢測,節(jié)省大量的時間和反應成本。隨著基因技術的,熒光定量PCR技術將會深入和拓展,在農業(yè)中得到更廣泛的應用。 6 1 MIKAEL K A,JOSE M A,MARTIN B,et al.The

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