活細(xì)胞鈣離子濃度熒光顯微檢測(cè)系統(tǒng)的研制和應(yīng)用

1、生物醫(yī)學(xué)工程研究JournalofBiomedicalEngineeringResearch活細(xì)胞鈣離子濃度熒光顯微檢測(cè)系統(tǒng)的研制和應(yīng)用蘭李,周云燕,楊志勇,瞿安連,徐濤(華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物物理與化學(xué)研究所,湖北武漢430074)摘要:研制了活細(xì)胞鈣離子濃度熒光顯微檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的工作原理是:氙燈發(fā)射的光線被橢球面鏡聚焦后以衍射光柵分光,通過(guò)光纖、雙路耦合聚光鏡和物鏡將單色光纖入樣本平面以激發(fā)細(xì)胞中的鈣離子熒光探針發(fā)出熒光,最后用光電倍增管檢測(cè)熒光信號(hào)。使用該系統(tǒng),測(cè)定了高K+去極化刺激下PC12細(xì)胞(大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)內(nèi)Ca2+i變化的動(dòng)態(tài)特性曲線。結(jié)果表明:靜息狀態(tài)下P

2、C12細(xì)胞內(nèi)Ca2+i為80.0±15.0nmol/L,高K+去極化刺激可使PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+i增加到1.9±0.2mol/L,上升至峰值時(shí)間約為20.1s。表明此系統(tǒng)可以滿足檢測(cè)活體細(xì)胞Ca2+i的需要。關(guān)鍵詞:熒光顯微鏡;胞內(nèi)鈣離子濃度;橢球面鏡;雙路耦合聚光鏡;PC12細(xì)胞;高鉀去極化中圖分類號(hào):Q-336;R318文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):167226278(2004)0220114204DevelopmentandApplicationoftheFluorescentMicroscopySystemforDetectingCa2+iinLivingCellsLA

3、NLi,ZHOUYun-yan,YANGZhi-yong,QUAn-lian,XUTao(InstituteofBiophysicsandBiochemistry,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430074China)Abstract:ThefluorescentmicroscopysystemtodetectCa2+iinlivingcellswasbuild.Inthissystem,thelightfromthexenonlightsourcewasconvergedbyellipticalmirroranddiffracte

4、dbydiffractiongrating;thentheopticalfiberanddual-couplingcondensortransmittedmonochromaticlighttothespecimenplanetogeneratethefluorescenceofthefluorescentprobewithinthecell;atlastthefluorescentsignalwas2+detectedbythephotomultipliertube.Usingthissystem,thedynamiccurveofCaiinPC12cellsafterhighK+depol

5、arizationwasgiven.TheresultsshowedthattherestinglevelsofCa2+iinPC12cellswere80.0±15.0nmol/L.AfterhighK+depolarizationwasgiven,thecon2centrationsofintracellularfreeCa2+iinPC12cellswereraisedby1.9±0.2mol/L,andthetimeofhigh-K+depolarizationstimulating2+Ca2+ielevationtoapeakpointwasabout20.1s.

6、TheseresultsverifythatthissystemissuitablefordetectingCaiinlivingcells.Keywords:Fluorescentmicroscope;IntracellularCa2+concentration(Ca2+i);Ellipticalmirror;Dual-couplingcondensor;PC12cells;HighK+depolarization采用鈣離子熒光探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子等信使物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定是研究細(xì)胞分泌活動(dòng)的重要技術(shù)手段。其基本原理是:用熒光探針標(biāo)記樣本中的鈣離子,根據(jù)樣本中的熒光探針特性單色光源發(fā)出單色光,誘發(fā)

7、出熒光。然后根據(jù)傳感器檢測(cè)到的熒光特性即可分析樣本中的鈣離子濃度1。在目前的生理學(xué)研究中,僅測(cè)量細(xì)胞中的靜息鈣離子濃度是不夠的,通常需要在監(jiān)測(cè)過(guò)程中改變鈣離子濃度以定量研究各因素對(duì)分泌的影響。Ca2+螯合物DM-nitro2基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30327001)phen和NitrophenylEGTA可用于快速且均勻的提升細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度,將此物質(zhì)與Ca2+染料通過(guò)膜片鉗電極或孵育的方法導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),然后經(jīng)過(guò)高能量的紫外光激發(fā),使Ca2+螯合物瞬時(shí)分解,鈣迅速且均勻升高。這種技術(shù)稱為鈣離子光解釋放技術(shù)?，F(xiàn)代生理學(xué)研究中,鈣離子熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)與光解釋放技術(shù)常結(jié)合使用。我們研制的

8、以熒光標(biāo)記法為基礎(chǔ)的活細(xì)胞鈣離子濃度檢測(cè)系統(tǒng)(下稱為熒光測(cè)鈣系統(tǒng))即基于上述原理,在提供對(duì)胞內(nèi)鈣離子定;國(guó)家自然科學(xué)基金資助重點(diǎn)項(xiàng)目(30130230)。作者簡(jiǎn)介:蘭李(1979-),男,華中科技大學(xué)碩士研究生。© 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.第2期蘭李,等1活細(xì)胞鈣離子濃度熒光顯微檢測(cè)系統(tǒng)的研制和應(yīng)用115量檢測(cè)手段的同時(shí),兼顧光解釋放實(shí)驗(yàn)的需要。1儀器設(shè)計(jì)熒光測(cè)鈣系統(tǒng)可分為單色光源、熒光顯微鏡、熒光采集系統(tǒng)(包括光電倍增管、CCD和監(jiān)視器)3個(gè)主要部分,見(jiàn)圖1。由于需

9、要同時(shí)引入光解釋放激發(fā)光,故設(shè)計(jì)了雙路耦合聚光鏡以引入兩路光。此系統(tǒng)中單色光源提供單色激發(fā)光,隨后光纖與雙路耦合聚光鏡將激發(fā)光引入熒光顯微鏡;熒光顯微鏡將激發(fā)光聚焦于樣本平面以誘發(fā)熒光;熒光采集系統(tǒng)采集并記錄熒光信號(hào)。計(jì)算機(jī)控制單色光波長(zhǎng)的切換、熒光信號(hào)的采集以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的初步處理。困難,此方案還是可取的。按此方案構(gòu)建單色光源的輸出功率-波長(zhǎng)曲線(光譜輸出),見(jiàn)圖3,曲線中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng),縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的輸出光功率。圖3中帶有標(biāo)記1的為德國(guó)TILLPhotonicsGmbH的Poly2chrome-在相應(yīng)波長(zhǎng)的光功率輸出,標(biāo)記2為同一家公司的Polychrome-在相應(yīng)波長(zhǎng)的光功率輸出。Polyc

10、hrome-IV采用150W氙燈,Polychrome-I與本單色光源采用75W氙燈。由此可見(jiàn),本光源的輸出功率基本與TILLPhotonicsGmbH的同類產(chǎn)品相當(dāng),而且在可見(jiàn)光譜段輸出穩(wěn)定,表明此光源不僅可以滿足熒光測(cè)鈣的需要,而且可滿足諸如綠色熒光蛋白檢測(cè)、FM染料檢測(cè)等多種不同實(shí)驗(yàn)的要求。圖1熒光測(cè)鈣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig1StructureofthefluorescencemicroscopysystemfordetectingCa2+i圖3單色光源光譜輸出(采用CoherentAuburnGroup公司(USA)出品的Field2masterGS型光功率計(jì)測(cè)量)Fig3Spectralou

11、tputofmonochromator(measuredbythepoweranalyzerFieldmasterGS,CoherentAuburnGroup,USA)我們的工作主要集中在單色光源、雙路耦合聚光鏡與熒光采集系統(tǒng)的研制上。按系統(tǒng)的運(yùn)行順序?qū)Ω鞑糠值男路f性作出說(shuō)明。1.1基于橢球面鏡的單色光源見(jiàn)圖2。1.2簡(jiǎn)潔實(shí)用的雙路光纖耦合鏡圖2單色光源光路原理圖Fig2Schematicdiagramofmonochromator本研究的主要工作原理是將氙燈光源發(fā)出的光線聚焦后準(zhǔn)直,再由光柵分解為單色光。其關(guān)鍵部件為氙燈的聚光鏡。國(guó)外同類產(chǎn)品采用的是難以加工的環(huán)面鏡,不適合本單色光源使用,因

12、此,我們使用易加工的橢球面鏡作為系統(tǒng)的聚光鏡。通過(guò)軟件模擬,相同條件下橢球鏡的實(shí)際可用匯聚能量是環(huán)面鏡的1.8倍。即使橢球鏡的安裝與調(diào)試比環(huán)面鏡雙路耦合聚光鏡主要功能為:(1)將光纖出射的單色光與光解激發(fā)光按顯微鏡物鏡參數(shù)準(zhǔn)直后引入顯微鏡;(2)將單色光與光解激發(fā)光按一定比例進(jìn)行配比輸出。為實(shí)現(xiàn)功能1,設(shè)計(jì)了優(yōu)化的四片式光學(xué)結(jié)構(gòu),進(jìn)行了精細(xì)的像差矯正、采用了針對(duì)所用波長(zhǎng)的增透膜并構(gòu)建了一體化的機(jī)械支架,從而保證樣本平面上獲得了足夠且均勻的照明。為實(shí)現(xiàn)功能2,采用二色分光鏡實(shí)現(xiàn)兩路光源的特定配比輸出。1.3高靈敏度、高信噪比的檢測(cè)機(jī)構(gòu)由于鈣離子實(shí)驗(yàn)中的輸出的熒光信號(hào)既微弱且信噪比較低,故使用HA

13、MAMATSUPhotonicsKK公司的高靈敏度H5784-2型光電倍增管作為檢測(cè)器,同時(shí)在檢測(cè)器外圍設(shè)計(jì)了增益電路與低通貝賽爾濾波電路,以提高輸出信號(hào)的品質(zhì)。2實(shí)驗(yàn)部分利用所開(kāi)發(fā)的熒光測(cè)鈣系統(tǒng),研究了高K+刺激對(duì)PC12細(xì)胞(大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)內(nèi)游離鈣離© 1995-2007 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.生物醫(yī)學(xué)工程研究第23卷116子濃度的影響。2.1試劑與溶液HEPES,Glucose及其它常用試劑均系Sigma公司產(chǎn)。Frua-2/AM為MolecularProbe產(chǎn)品。2.1.

14、1標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液NaCl135mmol/L,KCl2mmol/L,MgCl2.6H2O2mmol/L,HEPES10mmol/L,Glucose4g/L,CaCl2.2H2O5mmol/LpH=7.2滲透2.5結(jié)果與討論2.5.1胞內(nèi)游離Ca2+i計(jì)算采用雙波長(zhǎng)熒光測(cè)鈣法測(cè)量PC12細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。即將胞內(nèi)熒光探針在不同激發(fā)波長(zhǎng)(340nm、380nm)發(fā)射的熒光強(qiáng)度值,代入以下公式求出Ca2+i3:Ca2+i=Keff(RR)(Rmax-R)壓310mmol/L2.1.2高K+刺激液NaCl77mmol/L,KCl60mmol/L,MgCl2.6H2O2mmol/L,HEPES10mmo

15、l/L,Glucose4g/L,CaCl2.2H2O5mmol/LpH=7.2滲透壓295mmol/L2.1.3Fura-2/AM熒光試劑的配制(1)助溶母液(Pluronicstock)1gPluronicF-127+5mlDMSO(20%W/V);(2)Fura-2/AM母液50gFura-2/AM+50lPluronicstock+10ml細(xì)胞外液(-20保存);(3)最終溶液250lFura-2/AM母液+0.5ml其中R為兩種激發(fā)波長(zhǎng)下熒光強(qiáng)度的比值,即R=F(340)/F(380),為排除背景光的干擾,可減去背景光強(qiáng)度,即R=F(340)-F(280)/F(380)-F(280);

16、Rmin與Rmax分別對(duì)應(yīng)鈣離子濃度最小(零鈣)和最大(10mmol/L)時(shí)的R值,Keff為有效結(jié)合常數(shù)。2.5.2高K+去極化刺激對(duì)胞內(nèi)Ca2+i的影響本實(shí)細(xì)胞外液。2.2儀器與設(shè)備自制熒光單色激發(fā)光源、顯微鏡(AxiovertS100TV,ZEISS;Germany)、物鏡(UplanApo,100×/1.35OillrisOlympus;Japan)、光纖(=1.25mm,NA=0.25)、自制熒光信號(hào)檢測(cè)裝置、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(EPC9,HEKAElektronikGmbH;Germany)、數(shù)據(jù)采集及光源控制軟件(Pulse,HEKAElektronikGmbH;Ger2ma

17、ny)、數(shù)據(jù)處理軟件(IgorPro4.03)。2.3PC12細(xì)胞培養(yǎng)2驗(yàn)觀察了高濃度的K+溶液對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+i的影響。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)細(xì)胞采樣400次,一次采樣時(shí)間55ms,其中激發(fā)光波長(zhǎng)340nm下激發(fā)時(shí)間為15ms,380nm下15ms,其余時(shí)間保持激發(fā)光波長(zhǎng)為靜息波長(zhǎng)(280nm),采樣頻率10kHz。其中一次測(cè)量結(jié)果見(jiàn)圖4:前135s內(nèi),測(cè)定細(xì)胞靜息狀態(tài)下游離鈣離子濃度,開(kāi)始階段由于進(jìn)行了光照與清洗,細(xì)胞處于適應(yīng)期,故存在一定的鈣振蕩,測(cè)得的Ca2+i為60120nmol/L,均值約為80nmol/L。由文獻(xiàn)4得知,正常細(xì)胞內(nèi)Ca2+i為50150nmol/L,可見(jiàn)本系統(tǒng)測(cè)量結(jié)果

18、基本準(zhǔn)確。經(jīng)歷約90s后測(cè)量值穩(wěn)定在80nmol/L左右,持續(xù)至加入高K+刺激液方才改變,證明系統(tǒng)輸出特性相當(dāng)穩(wěn)定。加入高K+刺激液后,Ca2+i經(jīng)歷短期振蕩,迅速升高接近2mol/L。停止加藥后,局部高K+迅速擴(kuò)散,因此Ca2+i隨之下降到約200nmol/L,隨后在這一水平附近震蕩。本實(shí)驗(yàn)測(cè)量了58個(gè)細(xì)胞。其結(jié)果是,靜息狀態(tài)下PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+i為80.0±15.0nmol/L,高K+去極化刺激可使PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+i增加到1.9±0.mol/L,上升至峰值時(shí)間約為20.1s。上述結(jié)果與國(guó)外2文獻(xiàn)中使用TILLPhotonicsGmbH的同類產(chǎn)品所得出的結(jié)論完全

19、一致5,6。證明了本系統(tǒng)可以滿足生理學(xué)研究中檢測(cè)活體細(xì)胞Ca2+i的需要。復(fù)蘇后的PC12細(xì)胞接種于25ml培養(yǎng)瓶中,置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37、5%CO2)。隔日更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)液的成分為:CMEM85%,馬血清10%,胎牛血清5%,pH7.27.4。待細(xì)胞鋪滿瓶底,用0.25%胰蛋白酶消化,消化完全后加入DMEM+10%小牛血清終止消化,用吸管吹打均勻,接種入培養(yǎng)板(內(nèi)含預(yù)先用0.1%多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)處理的載玻片)中。培養(yǎng)24h后用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。2.4細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+i測(cè)定過(guò)程貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞載玻片用細(xì)胞外液清洗兩次后,浸泡在Fura-2/AM負(fù)載溶液中

20、37避光培育20min,讓熒光染料充分進(jìn)入細(xì)胞。隨后取出載玻片再用細(xì)胞外液洗2次,在熒光測(cè)鈣系統(tǒng)上測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為340nm和380nm,發(fā)射波長(zhǎng)為505nm。在一定時(shí)刻內(nèi)用微量進(jìn)樣器小心加入高K+刺激液,觀察它對(duì)所測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的影響。圖4高K+去極化刺激引起Ca2+i的快速升高,Ca2+i使用Ca2+探針Fura-2/AM測(cè)量Fig4HighK+depolarizationgeneratingrampCa2+iincreases,measuredCa2+ibyusingaCa2+in2dicator,Fura-2/AM© 1995-2007 Tsinghua

21、Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.第2期蘭李,等1活細(xì)胞鈣離子濃度熒光顯微檢測(cè)系統(tǒng)的研制和應(yīng)用1173結(jié)論Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的信使物質(zhì),調(diào)控細(xì)胞內(nèi)許多重要的生理過(guò)程。因此,Ca2+在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用一直是細(xì)胞生物學(xué)和生物物理學(xué)研究的重點(diǎn)7。近20年來(lái),細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光測(cè)定法得到了快速發(fā)展?；诒嚷薀晒夥ǖ幕罴?xì)胞鈣離子熒光顯微檢測(cè)系統(tǒng)的研制成功,為細(xì)胞內(nèi)Ca2+i的監(jiān)測(cè)提供了新的手段。此系統(tǒng)可以連續(xù)輸出波長(zhǎng)均勻的單色光,故可適應(yīng)未來(lái)各種新型Ca2+熒光指示劑,提供更多有關(guān)Ca2+信號(hào)的必要信息;同時(shí)此系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)

22、的靈敏度高,輸出信號(hào)的信噪比高,有助于更清晰的采集、分析鈣離子探針的熒光信號(hào)。借助此系統(tǒng),可以實(shí)時(shí)、無(wú)損傷的研究細(xì)胞內(nèi)Ca2+i濃度的變化情況,有助于研究者更深入的研究和了解鈣離子在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程和生物調(diào)控機(jī)制,弄清各信號(hào)系統(tǒng)之間的相互關(guān)系,找出細(xì)胞內(nèi)不同類型Ca2+是否能引起不同基因表達(dá)的原因,從而幫助生物學(xué)家及生理學(xué)家總結(jié)出Ca2+作為胞內(nèi)第二信使在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的規(guī)律。參考文獻(xiàn):1盧步峰,黃詒森,魯友明.用Fura雙波長(zhǎng)熒光法測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣J.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1994,21(3):275-277.2李海山,王金,朱衛(wèi)華,等.Fura-2探針對(duì)希土Y3+跨PC12細(xì)胞膜行為

23、研究J.無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào),1999,15(1):83-88.3康華光,等.膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用M.北京:科學(xué)出版社,2003.130-138.4許鑫華,傅英松,韓波,等.熒光標(biāo)記法檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的改進(jìn)J.科技通報(bào),2003,19(4):282-284.5TakuyaKishimoto,Ting-TingLiu,YasunoriNinomiya,etal.Ionse2lectivitiesoftheCa2+sensorsforexocytosisinratphaeochromocytomacellsJ.JournalofPhysiology,2001,533(3):627-637.6Tak

24、ahashiA,CamachoP,LechleiterJD,etal.Measurementofintracel2lularcalciumJ.PhysiologicalRev,1999,(79):1089.7鄒壽彬,陳良怡,康華光.胞內(nèi)鈣信號(hào)系統(tǒng)J.生命的化學(xué),2000,20(6):254-257.(收稿日期:2004-03-19)(上接107頁(yè))化學(xué)突觸的動(dòng)態(tài)特性進(jìn)行了模擬,signM.PWSPublishingCompany,1996.1-422.2閻平凡,張秋水.人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與模擬進(jìn)化計(jì)算M.北京:清華程序結(jié)果證實(shí)了此模型的合理性,能很好再現(xiàn)突觸的易化、壓抑、增強(qiáng),最后恢復(fù)到正常水平的變化過(guò)程。缺點(diǎn)是:對(duì)模型中各個(gè)函數(shù)的選取比較難以把握,函數(shù)選取的好壞將直接決定突觸動(dòng)態(tài)特性模擬效果,對(duì)于不同的突觸應(yīng)有不同的函數(shù)表達(dá)式,同時(shí)顯現(xiàn)了模型的靈活性。本研究模型的完善還需要進(jìn)一步探討,需要現(xiàn)代分子生物學(xué)對(duì)突觸的微觀解釋,如神經(jīng)遞質(zhì)在不同時(shí)刻釋放的速率,神經(jīng)遞質(zhì)的合成速率,胞內(nèi)Ca2+的高濃度性如何會(huì)導(dǎo)致物理上的變化,一般神經(jīng)終末的遞質(zhì)數(shù)量有多少,隨動(dòng)作電位到來(lái)而釋放遞質(zhì)的時(shí)間數(shù)量曲線等。但