紫外線對(duì)枯草芽孢桿菌誘變

1、紫外線誘導(dǎo)枯草芽孢桿紫外線誘導(dǎo)枯草芽孢桿 菌突變菌突變 第六組小組成員第六組小組成員 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本操作方法學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本操作方法實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1：對(duì)枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株進(jìn)行處理：對(duì)枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株進(jìn)行處理制備菌懸液。制備菌懸液。2：對(duì)紫外線進(jìn)行誘變處理。：對(duì)紫外線進(jìn)行誘變處理。實(shí)驗(yàn)材料和用具1 菌種:枯草芽孢桿菌2 培養(yǎng)基:淀粉培養(yǎng)基。3 主要藥品:牛肉膏、蛋白胨、Nacl、可溶性淀粉、碘液，生理鹽水。4主要器皿:試管、移液管、錐形瓶、量筒、燒杯、紫外燈、離心機(jī)、培養(yǎng)皿等。技術(shù)路線：材料器具準(zhǔn)備菌懸液制備平板制作紫外線誘變處理稀釋菌懸液稀釋涂

2、平板計(jì)算存活率及致死率操作步驟1.菌懸液制備將枯草芽孢桿菌接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)20h，使其活化，取已培養(yǎng)20 h 的活化枯草芽孢桿菌斜面一支，用10 mL 生理鹽水將菌苔洗下，倒入離心管中，離心(3000 r/min)15min，棄上清液，將菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌2 次，最后制成菌懸液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為108/mL。2. 平板制作將培養(yǎng)基熔化后，冷至45左右倒平板。3誘變處理用物理方法或化學(xué)方法，所用誘變劑種類及劑量的選擇可視具體情況決定，有時(shí)還可采用復(fù)合處理，可獲得更好的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)用紫外線照射的誘變方法。(1)紫外線處理 打開(kāi)紫外燈預(yù)熱20mi

3、n。取5mL 菌懸液放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，同時(shí)制作5 份。逐一操作，將培養(yǎng)皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處，照射l min 后打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，開(kāi)始照射，與照射處理開(kāi)始進(jìn)行攪拌，即時(shí)計(jì)算時(shí)間，照射時(shí)間分別為15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，誘變菌液在黑暗中保存12h 然后稀釋涂菌進(jìn)行初篩。(2)稀釋菌懸液 按10 倍稀釋至10-6，從10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培養(yǎng)基平板中(每個(gè)稀釋度均做3 個(gè)重復(fù))，然后涂菌并靜置，待菌液滲入培養(yǎng)基后倒置，于30恒溫培養(yǎng)23d。4稀釋涂平板 取未照射的菌懸液(作為對(duì)照)和照射過(guò)的菌懸液各0.5 mL 進(jìn)行不同

4、程度的稀釋。取最后3 個(gè)稀釋度的稀釋液涂于淀粉培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板加稀釋液0.1 mL，用無(wú)菌玻璃刮棒涂勻，培養(yǎng)48 h(用報(bào)紙包好平板)。注意在每個(gè)平板背后要標(biāo)明處理時(shí)間、稀釋度。注：枯草芽孢桿菌誘變前：稀釋至10-8，10-7,10-6，生理鹽水枯草芽孢桿菌照射1min稀釋至10-8,10-7,10-6，生理鹽水枯草芽孢桿菌照射2min稀釋至10-8,10-7，10-6，生理鹽水枯草芽孢桿菌照射3min稀釋至10-8，10 存活率將培養(yǎng)48 h 后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出對(duì)照樣品1 mL 菌液中的活菌數(shù)。 同樣計(jì)算用紫外線處理1、2、3min 后的存活細(xì)胞數(shù)及致死

5、率。注 意 事 項(xiàng)1：紫外線照射時(shí)注意保護(hù)眼睛和皮膚。2：誘變過(guò)程及誘變后的稀釋操作在無(wú)菌下進(jìn)行并黑暗中培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)論：實(shí)驗(yàn)失敗失敗原因分析：細(xì)節(jié)決定成敗1：制作牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基時(shí)，沒(méi)有調(diào)到合適的PH。2：培養(yǎng)基滅菌處理沒(méi)有處理好，導(dǎo)致雜菌沒(méi)有滅干凈。3：接種過(guò)程中由于在酒精燈上灼燒時(shí)間長(zhǎng)且沒(méi)有完全冷卻就進(jìn)行接種導(dǎo)致菌種被燙死。培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有長(zhǎng)出實(shí)驗(yàn)中所需菌落。失敗原因4：紫外線誘變過(guò)程及誘變后的稀釋操作沒(méi)有在無(wú)菌下進(jìn)行，在黑暗中培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短。5：涂平板時(shí)離酒精燈遠(yuǎn)進(jìn)，導(dǎo)致雜菌進(jìn)入，最后菌落沒(méi)有長(zhǎng)出，且其他雜菌生長(zhǎng)旺盛。6：由于以上所有操作都應(yīng)無(wú)菌操作進(jìn)行，但實(shí)際操作沒(méi)有做到

6、無(wú)菌操作，最后導(dǎo)致平板上菌落較雜，分不清枯草芽孢桿菌菌落無(wú)法計(jì)數(shù)。教訓(xùn)1：實(shí)驗(yàn)操作提前準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)操作提前準(zhǔn)備 材料及器材。材料及器材。2：無(wú)菌操作時(shí)嚴(yán)格：無(wú)菌操作時(shí)嚴(yán)格 按照無(wú)菌操作按照無(wú)菌操作 技術(shù)操作。技術(shù)操作。3 3：紫外線誘變處：紫外線誘變處 理時(shí)注意黑暗理時(shí)注意黑暗 培養(yǎng)。培養(yǎng)。4：遇到不會(huì)的要：遇到不會(huì)的要及時(shí)詢問(wèn)，不能及時(shí)詢問(wèn)，不能自己隨便做。自己隨便做。參考文獻(xiàn)：參考文獻(xiàn)：1李豪，車振明.微波誘變微生物育種的研究J.山西食品工業(yè)，2005,6（2）.簡(jiǎn)要概括了國(guó)內(nèi)外微波誘變育種領(lǐng)域的研究新進(jìn)展，對(duì)微波的生物學(xué)效應(yīng)及誘變微生物的機(jī)理進(jìn)行了總結(jié)和討論，在此基礎(chǔ)上探討了微波誘變微生物

7、育種的應(yīng)用性研究。最后，對(duì)本領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)行了展望。2孫金旭.乳酒酵母紫外誘變?cè)|(zhì)體制備研究J.釀酒科技，2008（6）.在乳酒酵母原生質(zhì)體形成率和再生率影響單因素研究的基礎(chǔ)上，對(duì)菌齡、酵解溫度、酵解時(shí)間、酶濃度、穩(wěn)滲劑采用L16（4）5正交試驗(yàn)，評(píng)價(jià)各因素的影響程度，得出適宜該菌原生質(zhì)體制備的條件。33周德明，馮友仁，梁帥周德明，馮友仁，梁帥. .木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶高產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶高產(chǎn)菌株的誘變育種菌株的誘變育種J.J.中國(guó)林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，中國(guó)林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,102009,10（5 5）. .利用低能利用低能N N 注入，對(duì)產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶注入，

8、對(duì)產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Mnp)(Mnp)和錳過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶(Lip)(Lip)活力均較高的菌株活力均較高的菌株N1023N1023進(jìn)行誘變，研究了不同能量和不同劑量進(jìn)行誘變，研究了不同能量和不同劑量N+N+離離子誘變后菌株的存活率與突變率、突變菌株的產(chǎn)酶活力及遺傳穩(wěn)定子誘變后菌株的存活率與突變率、突變菌株的產(chǎn)酶活力及遺傳穩(wěn)定性結(jié)果表明：不同能量和不同性結(jié)果表明：不同能量和不同N N 離子劑量注入對(duì)菌株有顯著影響，離子劑量注入對(duì)菌株有顯著影響，誘變菌株誘變菌株Nlo23jNlo23j產(chǎn)產(chǎn)Mnp11LipMnp11Lip雙酶活力分別提高了雙酶活力分別提高了27272929和和222258

9、58，同時(shí)誘變菌株，同時(shí)誘變菌株N1o23jN1o23j有很好的遺傳穩(wěn)定性有很好的遺傳穩(wěn)定性。44孟慶云，張鵬孟慶云，張鵬. .環(huán)境參數(shù)變化對(duì)環(huán)境參數(shù)變化對(duì)射線誘變微生物的影響射線誘變微生物的影響J.J.微微生物學(xué)通報(bào)，生物學(xué)通報(bào)，2000,272000,27（3 3）. .報(bào)告了在非自然環(huán)境中培養(yǎng)選育青霉菌苗株的一些結(jié)論。實(shí)驗(yàn)表明報(bào)告了在非自然環(huán)境中培養(yǎng)選育青霉菌苗株的一些結(jié)論。實(shí)驗(yàn)表明隨著輻射劑量的增加菌株的致死率也相應(yīng)增加；當(dāng)輻照劑量相同時(shí)，隨著輻射劑量的增加菌株的致死率也相應(yīng)增加；當(dāng)輻照劑量相同時(shí)，與自然環(huán)境相比其致死率有所提高，且隨著非自然環(huán)境參數(shù)值的增與自然環(huán)境相比其致死率有所提高

10、，且隨著非自然環(huán)境參數(shù)值的增加而增加。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為加而增加。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為300kV300kVm m、磁場(chǎng)強(qiáng)度為、磁場(chǎng)強(qiáng)度為600G600G時(shí)，正變率有時(shí)，正變率有一極大值。一極大值。5婁權(quán)，陳廣平.浸礦微生物紫外誘變選育及浸礦機(jī)理研究J.現(xiàn)代礦業(yè)，2004（2）.通過(guò)微生物的銅離子耐受性培養(yǎng)，選取可以浸出銅離子的酸性浸礦微生物，并利用紫外線照射對(duì)微生物進(jìn)行誘變培養(yǎng)，培育出一種可以高效浸出銅離子的酸性浸礦微生物。同時(shí)探討了微生物對(duì)銅離子的耐受性培育和紫外線誘變?cè)诟咝ЫV微生物選育中的應(yīng)用，以及浸礦微生物在礦山中的應(yīng)用前景。6丁學(xué)知，夏立秋.蘇云金桿菌高毒力菌株4.0718的快速選育J.中國(guó)生物防

11、治，2001,17（4）63-166.不同生態(tài)區(qū)域的早作地、果園和稻田采集的858份土樣中，分離篩選出蘇云壘桿菌30株選取一株具典型蘇云壘桿菌菌落特征和較高殺蟲(chóng)毒力的菌株70為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和兩次亞硝基胍的交替復(fù)合誘變，顯微涂片染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)菌體的伴孢晶體的形狀、大小、數(shù)量及芽孢與伴孢晶體的比倒與殺蟲(chóng)效力密切相關(guān)以這些特征為參考進(jìn)行一佚速韌篩和毒力生測(cè)復(fù)篩，篩選出一株高毒力突變殺蟲(chóng)菌株40718。該突變襪殺蟲(chóng)毒力與原始菌株相比提高了75倍，在6、12和24h內(nèi)供試小菜蛾三齡幼蟲(chóng)死亡率分別高達(dá)20、97和100此菌株的高效速效殺蟲(chóng)毒力經(jīng)連續(xù)l0代培養(yǎng)能穩(wěn)定遺傳。7石磊，梁運(yùn)章.物理因子對(duì)微生

12、物誘變作用的研究進(jìn)展J.內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006,1（1）.微生物與食品衛(wèi)生、醫(yī)藥健康、生態(tài)環(huán)境、資源使用、農(nóng)畜牧業(yè)等方面息息相關(guān)。用于工業(yè)生產(chǎn)上的微生物主要是從自然界篩選或選育的，為了獲得優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、低耗的工業(yè)微生物，人們采用各種物理因子對(duì)微生物進(jìn)行誘變處理的試驗(yàn)研究，并獲得成功，其中有些經(jīng)誘變的微生物菌株應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。介紹了近幾年人們用激光、電磁波、離子束等幾種物理因子對(duì)微生物進(jìn)行處理得到的一些研究成果及基本機(jī)理分析。8賈嘯靜.微生物藥物產(chǎn)生菌誘變育種方法的應(yīng)用和進(jìn)展J.河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2006,23（3）.產(chǎn)微生物藥物的原始菌株往往產(chǎn)量較低,為滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要,需要通過(guò)合適的誘變育種方法進(jìn)行改良。詳細(xì)介紹了目前較為通用的幾種物理和化學(xué)誘變育種技術(shù)及其應(yīng)用情況,同時(shí)簡(jiǎn)述了獲得高產(chǎn)突變株的幾種篩選方式。9許翠，高夢(mèng)祥.微生物菌種誘變篩選方法及其應(yīng)用J.長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），