被定位于發(fā)酵支原體表面的α烯醇化酶及其纖溶酶原活性

1、被定位于發(fā)酵支原體表面的烯醇化酶及其纖溶酶原活性摘要：結(jié)合與發(fā)酵支原體表面的纖溶酶原可以顯著的增強(qiáng)發(fā)酵支原體與HElA細(xì)胞的結(jié)合能力，并且尿激酶纖溶酶原激活物能夠加強(qiáng)該能力，并且在發(fā)酵支原體的內(nèi)吞話過(guò)程中也有此特性。在試驗(yàn)中，我們通過(guò)親和色譜分析法利用生物素標(biāo)記的纖溶酶原與抗生物素抗體將溶解于Triton X-100的發(fā)酵支原體蛋白中的纖溶酶原結(jié)合蛋白分離并溶解于氨基己酸溶液中。將分離得到的50KD左右大小的蛋白經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析得出是烯醇化酶。烯醇化酶這種在糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，通過(guò)免疫印記的方法應(yīng)用抗烯醇化酶抗體被證明在發(fā)酵支原體的膜蛋白組分中找存在，并應(yīng)用免疫電鏡與免疫化學(xué)的方法驗(yàn)證了此結(jié)論。

2、蛋白凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明纖溶酶原具有阻礙抗烯醇化酶抗體與發(fā)酵支原體50KD組分結(jié)合的能力，該結(jié)論進(jìn)一步證明了我們關(guān)于膜表面烯醇化酶是發(fā)酵支原體主要纖溶酶原金額和蛋白的推測(cè)。纖溶酶原(Plg)與發(fā)酵支原體表面結(jié)合可以作為一種標(biāo)記物加強(qiáng)其同Hela細(xì)胞組織的結(jié)合能力，因?yàn)槟蚣っ富钚缘睦w溶酶原激活劑可加強(qiáng)纖溶酶原活性從而著引導(dǎo)了宿主細(xì)胞對(duì)發(fā)酵支原體的內(nèi)吞作用加強(qiáng)。在我們的研究中，通過(guò)應(yīng)用親和色譜法我們通過(guò)用經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記的纖溶酶原結(jié)合柱分離用Triton X-100溶解的發(fā)酵支原體膜蛋白獲取分析其中具有纖溶酶原活性的的蛋白從而找到一種氨基酸。通過(guò)對(duì)這個(gè)50KDa 大小的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析得知它是烯醇化酶

3、。應(yīng)用抗烯醇化酶的抗體做的免疫印記分析證明烯醇化酶這種在胞內(nèi)糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶在發(fā)酵支原體表面也存在，并且通過(guò)免疫化學(xué)與免疫電鏡驗(yàn)分析驗(yàn)證了上述結(jié)論。我們還通過(guò)對(duì)膜表面蛋白western實(shí)驗(yàn)證明纖溶酶原具有阻礙抗烯醇化酶抗體同烯醇化酶結(jié)合的作用從而證明了位于膜表面的烯醇化酶是發(fā)酵支原體表面的主要纖溶酶原結(jié)合蛋白。支原體（柔膜菌綱）是一種沒(méi)有細(xì)胞壁并廣泛分布于自然界的一種生物。多數(shù)支原體是寄生生存，并且具有嚴(yán)格的宿主和組織特異性，且?guī)缀跛械姆N類(lèi)都附著于真核細(xì)胞的表面生存。在細(xì)胞定殖以及后續(xù)的疾病侵染過(guò)程中對(duì)宿主細(xì)胞的粘附作用是是初始并是必要的一步，從而導(dǎo)致了粘附缺陷株即無(wú)致病力毒株。幾十年前

4、人們就從人的泌尿生殖系統(tǒng)中分離到具有致病作用的發(fā)酵支原體。最近有研究表明該支原體可能是引起人關(guān)節(jié)炎的一種病原體因此對(duì)該病原的研究持續(xù)升溫。纖溶酶原是一種92KDa大小的真核生物內(nèi)存在的糖激酶活性的蛋白，并且其在體內(nèi)可通過(guò)賴(lài)氨酸的激活作用使其轉(zhuǎn)化為纖溶酶從而具有降解纖維蛋白與非膠原蛋白活性。纖溶酶活性在眾多生理與病理過(guò)程中都起到重要作用例如：纖維蛋白與細(xì)胞周質(zhì)蛋白水解、癌細(xì)胞的遷移以及神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。眾多真核細(xì)胞在其細(xì)胞表面會(huì)表達(dá)與纖溶酶相互作用的立體結(jié)構(gòu)，并且也已盡有人在細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)與纖溶酶相應(yīng)的受體。賴(lài)氨酸以及賴(lài)氨酸活性類(lèi)似物例如在羧基端有游離的賴(lài)氨酸殘基的氨基酸鏈都會(huì)對(duì)纖溶酶活性起到抑制

5、作用。最近的研究已盡表明纖溶酶原可以同大量的革蘭氏陽(yáng)性以及陰性菌其反應(yīng)。發(fā)酵支原體是一種典型的胞外寄生菌，它寄生于人類(lèi)上皮細(xì)胞表面。我們的研究表明了發(fā)酵支原體具有纖溶酶原結(jié)合活性并且纖溶酶原的結(jié)合能夠加強(qiáng)發(fā)酵支原體同HeLa細(xì)胞的結(jié)合作用。此外，在尿激酶活性的纖溶酶原激活劑存在的情況下，在宿主細(xì)胞胞內(nèi)檢測(cè)到了發(fā)酵支原體表明了纖溶酶原的結(jié)合活性以及纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶都能夠加強(qiáng)發(fā)酵支原體侵染宿主細(xì)胞。多種細(xì)菌都能夠產(chǎn)生纖溶酶分解細(xì)胞周質(zhì)從而利于它們能夠在組織上侵染與擴(kuò)散。細(xì)菌在其表面表達(dá)纖溶酶原的受體這樣將有利于血纖溶酶原與來(lái)自原核或者真核生物的血纖溶酶原激活劑接觸來(lái)加強(qiáng)血纖溶酶原的活性。也就是

6、說(shuō)細(xì)菌通過(guò)應(yīng)用血纖溶酶原的受體與激活劑來(lái)達(dá)到利用宿主細(xì)胞系統(tǒng)是本身具有蛋白水解酶的能力。對(duì)于革蘭氏陰性菌來(lái)說(shuō)其表面的纖毛與菌毛是受體的主要存在位點(diǎn)。對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌來(lái)說(shuō)其表面類(lèi)似于M蛋白樣分子結(jié)構(gòu)的表面粘附細(xì)胞器是受體的存在位點(diǎn)。作為糖酵解酶的烯醇化酶以及三磷酸甘油醛脫氫酶在肺炎鏈球菌中作為非經(jīng)典的血纖溶酶原結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)。纖溶酶原與肺炎鏈球菌烯醇化酶的結(jié)合是通過(guò)賴(lài)氨酸殘基端地結(jié)合集團(tuán)與烯醇化酶的羰基端以及內(nèi)部的FYDKERKVYD表面集團(tuán)相互作用實(shí)現(xiàn)的。在我們的研究中我們分離鑒定并表達(dá)了發(fā)酵支原體中作為表面能夠結(jié)合纖溶酶原的烯醇化酶。材料與方法樣本及其生長(zhǎng)環(huán)境。使用菌株為發(fā)酵支原體PG-18

7、菌株（由S.-C. Lo, Armed Forces Institute of Pathology, Washington, DC惠贈(zèng)），樣本組織用含有5的馬血清的Chanock培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)。樣本組織在37下培養(yǎng)24-48小時(shí)，在培養(yǎng)過(guò)程中時(shí)刻監(jiān)控培養(yǎng)基在640nm吸光度值與PH值的變化。12000g，20min離心收集組織樣品，清洗兩遍，用冷的含有10mM的Tris-HCl、250 mM NaCl（PH7.4，參照下文中TN緩沖液的配置）溶液重懸?？偟鞍琢繎?yīng)用Bradford方法進(jìn)行定量并將蛋白稀釋為0.5ug/ml到1.0ug/ml.細(xì)菌的計(jì)數(shù)通過(guò)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算稀釋后單個(gè)菌落數(shù)獲得。從菌體

8、中獲取膜蛋白上以及可溶性蛋白應(yīng)用超聲破碎的方法。獲取的組分沖洗兩遍并用TN緩沖液重懸備用。層析法與質(zhì)譜法利用層析法從人的血漿中獲取2.5mg的纖溶酶原，并應(yīng)用分配器按照說(shuō)明書(shū)對(duì)纖溶酶原標(biāo)記上生物素。標(biāo)記有生物素的纖溶酶原與附著有抗生物素蛋白的丙烯材料制備的小珠子（sigmar）共同于緩沖液中室溫孵育2h。用玻璃柱收集孵育完畢的珠子沖洗兩遍，并用含有1mM EDTA的PBS平衡。在填充柱中分離用含有2Triton X-100的溶液溶解的發(fā)酵支原體細(xì)胞膜組分。填充柱用還有2Triton X-100與1mM EDTA的PBS沖洗兩遍，然后用10-50mM的ACA溶液沖洗結(jié)合有纖溶酶原結(jié)合蛋白的珠子。

9、獲取的樣品經(jīng)過(guò)透析、冷凍干燥后用蛋白膠上樣緩沖液重懸，然后應(yīng)用4-20梯度的SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳。生物素標(biāo)記的纖溶酶原蛋白在結(jié)合反應(yīng)后應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)染色在50KD處可見(jiàn)主要的結(jié)合條帶，用銀染方法染色后還可以看見(jiàn)4條非主要的結(jié)合條帶（45KD 55KD 70KD 75KD）。應(yīng)用MS方法對(duì)49KD處用考染可見(jiàn)的主要的纖溶酶原結(jié)合蛋白條帶處獲取蛋白樣品并對(duì)其分析。將MS獲取的短肽鏈信息與MS相關(guān)信息應(yīng)用BioLynx package軟件進(jìn)行分析，其結(jié)果可在Mascot package 上查詢(xún)。應(yīng)用BLAST在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入獲取的蛋白樣品特征數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。烯醇化酶的定位 應(yīng)用斑點(diǎn)雜交

10、的方法對(duì)全菌蛋白、膜蛋白、包漿蛋白的可溶性組分進(jìn)行分析。醋酸纖維素膜應(yīng)用含有1BSA的PBS溶解的脫脂乳在室溫下封閉1h，應(yīng)用兔抗烯醇化酶抗體1:200被稀釋在4下孵育16h，用過(guò)氧化物辣根標(biāo)記的鼠抗兔IgG酶標(biāo)二抗室溫孵育1h，顯色。為了檢測(cè)憲溶酶原對(duì)抗烯醇化酶抗體與烯醇化酶結(jié)合能力影響的大小，我們對(duì)發(fā)酵支原體可溶性蛋白組分進(jìn)行SDS-PAGE。蛋白通過(guò)電專(zhuān)的方法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到醋酸纖維素膜上，并應(yīng)用沒(méi)有纖溶酶原（15ug）存在的抗烯醇化酶抗體溶液與具有纖溶酶原同抗烯醇化酶抗體一起孵育的作對(duì)照，其后的反應(yīng)如上文所述。應(yīng)用ELISA方法對(duì)兔抗烯醇化酶血清對(duì)發(fā)酵支原體可溶蛋白組分的的抗體稀釋度

11、進(jìn)行測(cè)定。ELISA空板子用發(fā)酵支原體全菌蛋白包被（包被濃度為0.1 到 5.0 ug/孔，溶解在含有10mM CaCl2 的TN緩沖液中），應(yīng)用含有1BSA PBS的脫脂乳室溫封閉2h，1:200倍兔抗烯醇化酶血清室溫孵育2h。再用過(guò)氧化物辣根標(biāo)記的鼠抗兔二抗37孵育1h，顯色，測(cè)吸光度值。電鏡技術(shù) 為了在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上確認(rèn)烯醇化酶存在的位置，我們利用透射電鏡對(duì)金標(biāo)記的發(fā)酵支原體進(jìn)行觀察，其中發(fā)酵支原體為在Chanock培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后經(jīng)過(guò)TN緩沖液沖洗兩遍后獲取的。將菌體蛋白濃縮到200ug/ml，將獲取的做分利用含有5胎牛血清的TN緩沖液封閉30分鐘，其后1:50倍用含有1BSA的T

12、N緩沖液稀釋兔抗烯醇化酶血清低溫孵育24個(gè)小時(shí)。經(jīng)過(guò)TN緩沖液的三次洗滌，用金標(biāo)記的山羊抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch Laboratories）在室溫下孵育三個(gè)小時(shí)。樣品經(jīng)過(guò)TN緩沖液的兩次洗滌，用含有2甲醛以及2戊二醛的0.2M甲次砷酸鹽溶液（PH7.4）低溫固定30分鐘。樣品在經(jīng)過(guò)冷凍切片處理后對(duì)其進(jìn)行電鏡觀察。結(jié)果與討論已經(jīng)有報(bào)道說(shuō)明，在有些支原體的表面纖溶酶原結(jié)合活性是具有賴(lài)氨酸依賴(lài)活性的。纖溶酶原能夠結(jié)合在發(fā)酵支原體表面，并且這種結(jié)合加強(qiáng)了它對(duì)HeLa的粘附能力都說(shuō)明了在纖溶酶原的幫助下發(fā)酵支原體是通過(guò)結(jié)合HeLa細(xì)胞表面幾個(gè)特定位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)粘附過(guò)程的。眾多細(xì)菌

13、在其表面都表達(dá)纖溶酶原結(jié)合受體，這些受體結(jié)合纖溶酶原并且這些纖溶酶原在激活劑的存在下轉(zhuǎn)化為纖溶酶酶從而在細(xì)菌的侵染過(guò)程中起到促進(jìn)作用。此外，包括發(fā)酵支原體在內(nèi)的眾多細(xì)菌的侵染力都與其纖溶酶原結(jié)合能力與纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶有關(guān)。應(yīng)用發(fā)射自顯影技術(shù)，在發(fā)酵支原體蛋白組分中找到倆個(gè)條帶能與I125標(biāo)記的纖溶酶原反應(yīng)。我們應(yīng)用生物素標(biāo)記的纖溶酶原以及生物素結(jié)合吸附柱對(duì)發(fā)酵支原體膜上的以及可溶組分的蛋白進(jìn)行分離纖溶酶原結(jié)合蛋白。最終獲取了主要的一種大小為50KD的蛋白并溶解于ACA溶液中。對(duì)獲取的樣品進(jìn)行處理并通過(guò)MS-MS分析。通過(guò)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示出高度可信的該蛋白與其他支原體的烯醇化酶為同一

14、種蛋白。通過(guò)應(yīng)用配體實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)和電鏡實(shí)驗(yàn)證明烯醇化酶這種糖酵解酶存在于發(fā)酵支原體表面。圖表一的免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)表明在發(fā)酵支原體的膜蛋白組分中可以應(yīng)用兔抗烯醇化酶抗體檢測(cè)到烯醇化酶的存在。此外還可以看到，膜蛋白組分中的烯醇化酶含量高于可溶性蛋白組分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，不管是應(yīng)用含有NaCl（濃度可高達(dá)1M）的10 mM Tris緩沖液（pH 7.5）還是含有10mM EDTA的TN緩沖液作為洗滌液都對(duì)烯醇化酶抗體水平都沒(méi)有影響。表二顯示出兔抗烯醇化酶抗體與發(fā)酵支原體反應(yīng)的抗體水平。通過(guò)三維電鏡可以跟直觀的看出兔抗烯醇化酶抗體與發(fā)酵支原體的結(jié)合反應(yīng)（圖表3）顯示出烯醇化酶存在于發(fā)酵支原體表面。

15、圖表四顯示的纖溶酶原阻礙了抗烯醇化酶抗體與發(fā)酵支原體表面以及可溶性組分SDS-PAGE中50KD蛋白的結(jié)合反應(yīng)，從而證實(shí)了我們關(guān)于烯醇化酶作為發(fā)酵支原體表面的主要纖溶酶原結(jié)合蛋白的推論。此外我們還通過(guò)利用在孵育溶液中加上商品化地烯醇化酶阻礙了纖溶酶原與發(fā)酵支原體的結(jié)合，進(jìn)一步驗(yàn)證開(kāi)了我們的結(jié)論（沒(méi)顯示數(shù)據(jù)）。即是增加足夠大量的烯醇化酶（20 mg/孔），在發(fā)酵支原體蛋白組分與纖溶酶原結(jié)合反應(yīng)中也只是能夠抑制大約50結(jié)合能力，因此可推斷在發(fā)酵支原體表面還存在著其它的纖溶酶原結(jié)合蛋白。獲取發(fā)酵支原體全基因組序列（來(lái)自A. Strittmatter, The University of Goettingen, personal communications）讓我們能夠進(jìn)一步研究發(fā)酵支原體中烯醇化酶的基因序列。通過(guò)基因序列可計(jì)算出該氨基酸連有454個(gè)氨基酸殘基組成，并計(jì)算出其大小為49,276 Da。在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST該烯醇化酶的氨基酸序列。通過(guò)ClustalW方法分析比對(duì)了發(fā)酵支原體烯醇化酶的氨基酸序列同其它生物體該蛋白的相似性。同肺炎雙球菌一樣，發(fā)酵支原體中的烯醇化酶缺乏錨定在膜上的典型序列或者結(jié)構(gòu)域。不但多種支原體的烯醇化酶基因序列之間