熒光假單胞菌生防機(jī)理的研究進(jìn)展

1、 收稿日期 :2006-11-14; 修回日期 :2007-04-02作者簡介 :張偉瓊 (1981- , 女 , 上海師范大學(xué)微生物分子生物學(xué)碩士研究生 , 主要從事微生物分子生物學(xué)研究 ; 通訊作者 :肖 明 E -mail:xiaom ing88,基金項(xiàng)目 :上海市科委重大項(xiàng)目 (批準(zhǔn)號 :04DZl9304 ; 上海市教委重點(diǎn)項(xiàng)目 (05ZZl4 資助熒光假單胞菌生防機(jī)理的研究進(jìn)展張偉瓊 , 聶 明 , 肖 明(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 , 上海 200234摘 要 :熒光假單胞菌是植物根際促生細(xì)菌 (Plant Gr owth Pr omoting

2、Rhizobacteria, PGPR 具有分布廣 、 數(shù)量多 、 營養(yǎng) 需要簡單 、 繁殖快 、 競爭定殖力強(qiáng)的特點(diǎn) 。 , 成為 植物生防控制的重要研究對象 。 主要論述了熒光假單胞菌對植物病害生物防治機(jī)理的研究進(jìn)展 關(guān)鍵詞 :熒光假單胞菌 ; 生防機(jī)理 ; 植物病害 中圖分類號 :Q939. 96文獻(xiàn)標(biāo)識碼 :A:( -03 熒光假單胞菌 (P. fluorescens r RNA I 群熒光 DNA 同源組 1, 生物類群 , 具有分布廣、 快 、 , 而且許多菌株能 , 2。其作用機(jī)制包括 :抗生素的作用、 噬鐵素對鐵的營養(yǎng)競爭、 有效的根際定 殖等。 近年來 , 隨著分子生物學(xué)的廣

3、泛滲入 , 通過對這 些作用機(jī)制的遺傳性狀進(jìn)行分析 , 采用遺傳工程加以 改良 , 使得熒光假單胞菌具有更誘人的生防效果 。 1 抗生素介導(dǎo)的抑制熒光假單胞菌產(chǎn)生的抗生素是它們抑制植物病害 的重要 因 素。它 們 產(chǎn) 生 的 抗 生 素 有 1-羧 基 吩 嗪 (phenazin -e -1-carboxylic acid, PCA , 藤黃綠膿菌 素 (pyoluteorin, Plt , 吡咯菌素 (pyrr olnitrin, Prn , 2, 4-二乙酰藤黃酚 (2, 4-diacetylphloroglucinol, DAPG , 綠 膿菌素 (pyocyanin , 卵菌素 A (

4、OomycinA 等。這些抗 生素具有一定的專一性 , 能夠選擇性地抑制病害。表 1列出了熒光假單胞菌產(chǎn)生的一些抗生素及其拮抗的 植物病原菌。目前的研究主要集中在 PCA 、 Prn 、 Plt 和 DAPG 這 幾種抗生素上。 PCA 為吩嗪類物質(zhì) , 在細(xì)胞內(nèi)作為電 子載體傳遞電子到靶細(xì)胞 , 增加胞內(nèi)超氧化物自由基 , 使靶細(xì)胞中毒死亡 ; Prn 屬于氨基糖甘類抗生素 , 在低 濃度時破壞氧化磷酸化的偶聯(lián)機(jī)制 , 而在高濃度時阻 止參與呼吸作用的黃素蛋白和細(xì)胞色素 C 的電子運(yùn) 輸 3; Plt 和 DAPG 為聚酮類抗生素 , 具有廣譜抗菌活 。1986年 Guuters on 等人

5、首次報道克隆得到菌株 P. fluorescens HV37a 的抗生素基因。該菌株抗生素的合 成與 轉(zhuǎn) 錄 單 位。 afuE 、 afaR 、 afuAB 、 afuP 有 關(guān) , 其 中 afuAB 與調(diào)節(jié)相關(guān)。 之后越來越多菌株合成抗生素的 基因得到確定。在熒光假單胞菌 Q2-78中 phl ACBD 作為操縱子負(fù)責(zé)合成 DAPG 及其前體 , 下游基因 phlE 與 phl ACBD 共轉(zhuǎn)錄 , 與 DAPG 的分泌和細(xì)胞抗逆性相 關(guān) , phlF 基因位于操縱子上游 , 以相反的方向轉(zhuǎn)錄 , 編 碼 DAPG 阻遏蛋白 。 不同菌株 DAPG 合成基因序列具有較高的相似性 4。 D

6、m itri 等人測定了熒光假單胞菌 2-79中 PCA 合成相關(guān)基因 phz ABCD EFG, 其中 phzC 、 phz D 、 phzE 、 phzF 是 PCA 合成所必需的。 phzG 與 PCA 合成酶輔助因子相關(guān)。 phz A 和 phz B 具有高度同源性 , 與合成 PCA 的多酶復(fù)合物的穩(wěn)定有關(guān)。不同熒光假單胞菌也具有相似的基因系統(tǒng)合成 PCA 5。熒光假單胞菌通過兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng) (t wo -co mpo 2nent regulation system 應(yīng)答環(huán)境信號 , 系統(tǒng)由膜連接傳 感激酶 (membrane -bound sens or kinase 和胞質(zhì)效應(yīng)蛋

7、 白 (cyt op las m ic response p r otein 組成 , 其中傳感激酶起 環(huán)境感受器作用 , 而胞質(zhì)效應(yīng)蛋白介導(dǎo)根據(jù)傳感信號 而變化的基因表達(dá)。 熒光假單胞菌的兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng) GacS/GacA 中 , gacS 基因編碼膜連接傳感激酶 GacS, gac A 基因編碼胞質(zhì)效應(yīng)蛋白 GacA 。 gacS 或 gac A 突變 體喪火產(chǎn)生一系列抗生素的能力 , 從而失去對植物致 病菌的抑制能力。 如熒光假單胞菌 Pf -5的 gacS 突變 體喪失產(chǎn)生 Prn 、 Plt 、 DAPG 的能力 , 因此失去了對植物9第 24卷第 3期 2007年 6月生 物 學(xué)

8、雜 志 JOURNAL OF B I O LOGYVol 124 No 13Jun, 2007致病菌 Rhizoctonla solani 的抑制能力 。菌株 FPT960l 的 gac A 突變體不產(chǎn)生 DAPG 、 HCN 和蛋白酶 , 但產(chǎn)生過量的噬鐵素 Sid 6。 隨著兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的鑒定 , 能 更好地提高熒光假單胞菌中抗生素的基因調(diào)控 。表 1 熒光假單胞菌產(chǎn)生的抗生素與其所拮抗的植物病原菌Table 1Antibi ofics of Pseudo m onas fluorescens and its functi on objects抗生素植物病原菌Pyrr olnitrin,

9、 PrnR hizoctonia solani Thielaviopsis basicola A lternana sp Pythium ulti m umPyoluteorin, PitPythium ulti m umPhenazine -1-Carboxylic Acid, PCA Gaeum anno m yces gram inis 2, 4-diacetyl phl or oglucinol, 2, 4-DAPGR hizoctonia solani Gaeum anno m yces gram inis Pythium ulti m umOomycin A Pythium ult

10、i m um 反應(yīng)控制 , 而 GacS/GacA 。 D (70因子由 rpo D 基因編碼 , Pf D 過量表達(dá)使 Plt 和 DAPG 產(chǎn) 量提高 , 而熒光假單胞菌 M18中 rpo D 過量表達(dá)增強(qiáng)了Plt 和 PCA 的生物合成。 S (38因子由 rpoS 基因編 碼 , 在 M18中 rpoS 失活使其合成 PCA 的能力顯著提 高 , 但對碳源饑餓 、 有機(jī)物 、 過氧化物和高滲透壓的抗逆性降低 , 不利于菌體的生長 7。 Pf -5的絲氨酸蛋白 酶 Lon 突變體產(chǎn)生過量的 Plt, 并對 UV 較為敏感。 lon基因前端序列類似于 E . coli 熱震蕩 H (32因

11、子的啟動子 , 因此 H因子也調(diào)節(jié)熒光假單胞菌種抗生素的產(chǎn) 生 8。 由此推測 , 熒光假單胞菌中抗生素合成的阻遏 蛋白的編碼基因是依賴于 因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或者與 因 子相互競爭 RNA 聚合酶 。此外 , 抗生素的產(chǎn)生還受到不同生理?xiàng)l件的影響。 B rion 等發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌 CHAO 中 DAPG 及其前體化合物的產(chǎn)生受到 Zn 2+、 NH 4Mo 2+及葡萄糖的刺激 ; Plt的產(chǎn)生受 Zn 2+、 CO 2+和甘油的刺激但受葡萄糖的抑制 ; 果糖 、 甘露醇、 Zn 2+和 NH 4Mo 2+混合物能夠增加 Prn 的產(chǎn)量 ; DAPG 產(chǎn)生的最適溫度為 12。 Notz 等還發(fā) 現(xiàn)

12、Fusarium oxysporum 產(chǎn)生的鐮刀菌酸能抑制 CHAO產(chǎn)生 DAPG 9。 2 噬鐵素介導(dǎo)的抑制熒光噬鐵素是由熒光假單胞菌產(chǎn)生的胞外水溶性 黃綠色素 , 是其特有的鐵載體 。 19世紀(jì) 70年代 A ltam 等人首次提出熒光假單胞菌產(chǎn)生的噬鐵素促進(jìn)植物生 長并抑制植物病害。 1980年 Kl oepper 等首次從熒光假 單胞菌 B10中分離出具有植物病害抑制能力的熒光噬 鐵素 。熒光噬鐵素抑制植物病害的作用機(jī)理是在低鐵環(huán) 境下熒光假單胞菌產(chǎn)生與鐵離子有極高親和力的熒光 噬鐵素 , 形成鐵 -噬鐵素復(fù)合物。產(chǎn)生菌通過膜外專 一性受體利用復(fù)合物 , 而其它機(jī)體不能利用。因此熒 光

13、假單胞菌通過分泌噬鐵素從環(huán)境中結(jié)合鐵離子為自 身所利用 , 限制植物根際有害細(xì)菌和真菌的生長 , 防止 真菌孢子萌發(fā)。鐵 -噬鐵素復(fù)合物的攝取是由專一性膜外受體所 介導(dǎo)的 。 1986年 Buyer 等首次提出熒光假單胞菌具有 多種受體攝取不同的鐵 -噬鐵素復(fù)合物。他們發(fā)現(xiàn)菌 株 B10不僅能夠利用菌株 A214, 而 B10A214, E . 蛋白在細(xì)胞外膜轉(zhuǎn)運(yùn)中介導(dǎo)膜內(nèi)外 , 是 E . coil 所有鐵 噬鐵素復(fù)合物運(yùn)輸系統(tǒng)中 所必須 的。熒 光假 單胞 菌 358的 受 體 序 列 具 有 與 TonB 蛋白結(jié)合位點(diǎn)同源的區(qū)域 , 因此在熒光假單胞菌 中復(fù)合物也許也通過同樣的方法穿過細(xì)

14、胞膜。大多細(xì)菌包括熒光假單胞菌具有 Fe 3+還原酶 , 噬鐵素與二價 金屬的親和力極小 , 因此認(rèn)為復(fù)合物與受體結(jié)合進(jìn)入 細(xì)胞之后鐵離子通過還原機(jī)制從噬鐵素中釋放出來?，F(xiàn)已 發(fā) 現(xiàn) 的 熒 光 假 單 胞 菌 噬 鐵 素 有 膿 青 素 (pyoverdine 、 假單胞菌素 (p seodobactin 、 綠膿菌螯鐵 蛋白 (pyochelin 、 水楊酸 (S A 等。噬鐵索的產(chǎn)生受到許多因素的影響 , 如 Co 2+、 果糖、 甘露醇、 葡萄糖和甘 油均能增加熒光假單胞菌 CHAO 中綠膿菌螯鐵蛋白 (pyochelin 的產(chǎn)量 。 3 根部定殖事實(shí)上 , 熒光假單胞菌所有的疾病抑制

15、機(jī)制只有 在它們成功地在根際定殖后才能真正起作用。楊合同 等人以熒光假單胞菌 P32處理小麥種子 , 發(fā)現(xiàn)菌株能 在幼根表面形成一層均勻的保護(hù)層 ; 而沒有防病作用 的菌株不產(chǎn)生保護(hù)層 , 說明熒光假單胞菌在根部定殖 時保護(hù)了病原菌的侵染位點(diǎn) , 降低侵染機(jī)會 , 是防病的 關(guān)鍵因素之一。不同的熒光假單胞菌在不同的根際有不同的定殖 能力 。 有報道表明一株熒光假單胞菌定殖于土豆根際 時 , 在砂質(zhì)土壤的定殖速度是粘土的 10倍 , 而另一株 則在砂質(zhì)土壤的定殖能力高于泥炭土壤。雖然這表明 土壤的結(jié)構(gòu)直接影響了菌株在根際的定殖 , 但其它與 土壤類型相關(guān)的間接因素如濕度、 溫度、 pH 值等也是

16、 根部定殖不同的原因。其他生物體的存在也影響根際定殖 , 如蛭弧菌屬 是土壤中革蘭氏陰性菌的專性寄生菌 , Scherff 等發(fā)現(xiàn) 它們影響大豆根際中熒光假單胞菌的存活。 Daniel 等 發(fā)現(xiàn)土壤中存在大量噬菌體作用于不同的熒光假單胞1第 24卷第 3期 2007年 6月生 物 學(xué) 雜 志 JOURNAL OF B I O LOGYVol 124 No 13Jun, 2007菌 , 這些噬菌體對細(xì)胞的溶解也影響熒光假單胞菌的 定殖 。 當(dāng)某一特殊噬菌體存在時敏感菌株的定殖能力 下降 , 而抗性菌株不受影響 。4 其它機(jī)制4. 1 次生抗性代謝物熒光假單胞菌還產(chǎn)生許多其它具有抗性的次生代 謝物

17、 , 與植物病原菌具有拮抗作用。 如許多熒光假單胞 菌產(chǎn)生的 HCN 能影響植物的病原菌。 M. Nagara jku mar 等發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌 Pf M DU2產(chǎn)生乙二酸 , 對植物病原 菌產(chǎn)生的草酸具有解毒作用 , 能夠抗由 Rhizoctonia solani 引起的水稻疾病 10。 N ielsen 等發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌 96. 578產(chǎn)環(huán)形脂肽 , 對病原菌 Rhizoctonia solini 有拮抗作 用 11; 在沙質(zhì)土壤中甜菜的根際發(fā)現(xiàn)大量熒光假單胞 菌產(chǎn)循環(huán)脂肽 CLPs (約 60% , 這些 CLPs 均表現(xiàn)出極 強(qiáng)的生物表面活性劑特性 ,物病原菌 12。 、 酶 、真

18、菌細(xì)胞壁 , W36株真菌的生長。4. 2一些熒光假單胞菌在根部的定殖能誘導(dǎo)植物對病 原菌產(chǎn)生系統(tǒng)抗性 (I nduced System ic Resistance, ISR , 水楊酸的積累被認(rèn)為是重要因素 , 而脂多糖和噬鐵素 也是重要的誘導(dǎo)物質(zhì)。 誘導(dǎo)抗性的可能機(jī)制是產(chǎn)生抗 微生物的低分子量化學(xué)物質(zhì) , 如植物保護(hù)素、 雙萜、 多 聚物 、 木質(zhì)素等并誘導(dǎo)一些水解酶和氧化酶 13。 Van 等人用 P. fluorcescens W SC417處理康乃馨花 , 再接種 鐮刀萎蔫病病原菌 , 明顯提高了康乃馨的植物保衛(wèi)素 水平 。 已發(fā)現(xiàn)一些生長旺盛的植物其內(nèi)生的熒光假單 胞菌的數(shù)量特別高

19、 14, 這也許與內(nèi)生熒光假單胞菌誘 導(dǎo)系統(tǒng)抗性作用有關(guān)。4. 3 基因工程構(gòu)建隨著基因工程的發(fā)展 , 更多的特性被引入熒光假 單胞 菌 , 使 其 能 更 有 效 地 抗 植 物 病 原 菌 。 1986年 Obukowicz 等將 B acillus thuringiensis 的 內(nèi)毒素插入一 株熒光假單胞菌的染色體 , 使重組菌株能夠抑制某些 昆蟲 。 Fuchs 等將 Serratia m arcescens 甲殼酶編碼基因 克隆到熒光假單胞菌并表達(dá)。在國內(nèi) , 丁之銓等人將 B t 殺蟲基因?qū)霟晒饧賳伟?P3O3, 工程菌 IPP202不僅在拮抗性方面沒有減弱 , 并且還具有殺

20、蟲作用 。 5 問題與展望熒光假單胞菌作為植物根際促生細(xì)菌對多種植物 病害具有防治作用 , 但在應(yīng)用上仍有許多問題。熒光 假單胞菌的防治效果一般為 50%60%, 需通過優(yōu)良 菌株的篩選提高效率。 次生代謝物抑制病害的具體機(jī) 制并未完全搞清 , 是否還有其他作用機(jī)制尚無定論。 基因研究表明在改進(jìn)這些菌株生防控制能力及多樣性 上還有極大的潛能 , 然而將基因修飾有機(jī)體 (G MO s 釋 放到環(huán)境中卻存在不可預(yù)測的風(fēng)險。 因此這些都還有 待科學(xué)工作者的進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn) :1東秀珠 , 蔡妙英 . 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊 M.北京 :科學(xué) 出版社 , 2002. 162166.2李懷波 , 彭

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28、如制造納米級的生物器件 , 更加有效 的利用能源等等 , 利用分子馬達(dá)在微觀層次上的特有 的功能為人類服務(wù)。參考文獻(xiàn) :1George O ster, Hongyun W ang . Reverse engineering a p r o 2tein:the mechanoche m istry of ATP synthase J .B i ochi m B i ophys Acta, 2002, 1458(2-3 :482510.2韓英榮 , 旋轉(zhuǎn)分子馬達(dá)的代表 ATP 合成酶 J , 現(xiàn)代物理知識 , 2003, 3:710.3翟中和 , 王喜忠 , 丁明孝 . 細(xì)胞生物學(xué) M, 北京 :

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32、andan Nor mal University, Hebei 056005, China Abstract:The ATPpases synthesize ATP using a trans me mbrane i on motive f orce established by electr oche m i 2cal gradient or revrse t o perf or m as i on pu mp using the hydr olysis energy of ATP . it has very high efficiency of ener 2gy transfor mati on, nearly 100%.I n this paper, baesd on the structure of the ATPase and the master equati on, a st o 2chastic hopp ing model which describes the r otary f our -state