蛋清溶菌酶的制備及活力測(cè)定

1、蛋清溶菌酶的制備及活力測(cè)定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。2.掌握溶菌酶的提取及活力測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理溶菌酶又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種堿性糖苷水解酶，能作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的粘多糖，具有殺菌等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床。溶菌酶存在于植物漿及動(dòng)物(蛋清、血漿、淋巴液和鼻粘膜等處)組織中，其中雞蛋清中含量較為豐富，且雞蛋清取材方便，因此實(shí)驗(yàn)室及實(shí)際生產(chǎn)中一般以雞蛋清為原料進(jìn)行溶菌酶的提取制備。從雞蛋清中分離溶菌酶可以選用多種不同的方法和步驟。本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化步驟為：等電點(diǎn)及熱變性選擇性沉淀聚丙烯酸處理葡聚糖凝膠柱層析聚乙二醇濃縮。溶菌酶具有耐熱性，在酸性

2、條件下經(jīng)受長(zhǎng)時(shí)間高溫處理而不喪失活性；而且溶菌酶又具有特別高的等電點(diǎn)，因此采用熱變性與等電點(diǎn)沉淀相結(jié)合的方法可除去大部分的雜蛋白。聚丙烯酸是一種多聚蛋白質(zhì)，在酸性條件下可以與溶菌酶結(jié)合形成凝聚物；當(dāng)有鈣離子存在時(shí)溶菌酶又能從這種凝聚物中分離出來(lái)，同時(shí)生成丙烯酸鈣沉淀，后者經(jīng)過(guò)硫酸的酸化又重新形成聚丙烯酸。在實(shí)驗(yàn)中，一旦提取液中溶菌酶與聚丙烯酸結(jié)合，所形成的凝聚物會(huì)立即粘附于試管的底部，傾去上層液體可使溶菌酶既得到純化，又得到濃縮。最后再用葡聚糖凝膠柱層析，使雜蛋白、溶菌酶和鈣離子分開(kāi)。三、儀器和試劑儀器玻璃層析柱(2.5cm×34cm)、電熱恒溫水浴鍋、離心沉淀機(jī)、10L 微量進(jìn)樣器

3、、721型分光光度計(jì)。試劑1. Sephadex G-502. 1%NaCl0.05mol/LHCl3. 20%HAc4. 10%聚丙烯酸(現(xiàn)配現(xiàn)用)5. 0.5mol/LNa2CO36. 500g/LCaCl27. NaCl8. 6g/LNaCl9. 飽和草酸溶液；10. 細(xì)菌懸液：取1g 艷紅K-2BP 標(biāo)記的微球菌M.lysodeikticus 懸于100mL0.5mol/L 的pH6.5磷酸緩沖液中，置于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?1. 乳化劑：2g Brij-35(聚氧乙烯脂肪醇醚)加50mL 蒸餾水微熱使溶解，冷卻后定容至100mL。吸取此液10mL 用0.6mol/LHCl 定容至200m

4、L 備用。12. 0.5mol/L 的pH6.5磷酸緩沖液。四、操作步驟(一)蛋清溶菌酶的分離提取1.變性與等電點(diǎn)選擇性沉淀：取新鮮蛋清用1%NaCl-0.05mol/LHCl 溶液攪拌稀釋?zhuān)?0%HAc 調(diào)至pH4.6，3000r/min 離心10min，收集濾液并記錄體積，留樣2mL()待分析。將濾液置于沸水浴使3min 內(nèi)迅速升溫至75，用流動(dòng)水速冷后，3000r/min 離心20min，收集上清液，紀(jì)錄體積，并留樣2mL()待分析。2.丙烯酸處理：將所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量為清液體積的1/4)，慢速攪拌，當(dāng)凝聚物出現(xiàn)后，靜置30min 使凝聚物粘附于容器底

5、部。傾去上清液，加入蒸餾水約1mL，并滴加少量0.5mol/LNa2CO3，使沉淀溶解，此時(shí)溶液pH6左右。攪拌條件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(體積為聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀擠壓干后棄去。如所得溶液不夠澄清，可以進(jìn)行離心或簡(jiǎn)單過(guò)濾，并用少量水洗滌濾紙。收集濾液于刻度試管，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。3.Sephadex G-50 柱層析(1)裝柱：稱(chēng)取15g Sephadex G-50，加入300mL 蒸餾水溶脹6小時(shí)以上，置熱水浴中加熱除去氣泡，冷卻后裝入玻璃層析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡層析柱。(2)上樣：向樣液中加入固體NaCl 使終濃度

6、為50g/L，上樣時(shí)先吸去層析柱凝膠面上的溶液，再沿管壁滴加樣品，樣品量不宜超過(guò)10mL。加完后打開(kāi)層析柱出口，讓樣品均勻流入凝膠內(nèi)。(3)洗脫：樣品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl 洗脫液洗下柱壁上的樣品，然后接通蠕動(dòng)泵，繼續(xù)6g/LNaCl 洗脫，調(diào)節(jié)操作壓力使流速控制在78mL/10min，部分收集器收集，10min 一管，共收集200mL 左右。(4)分析：紀(jì)錄各管體積，紫外光吸收法測(cè)定各管中蛋白質(zhì)濃度。合并含有蛋白質(zhì)的收集管，草酸鑒定Ca2+ ，留樣()待分析。4.乙二醇濃縮：將洗脫液放入透析袋，外面裹以聚乙二醇，置于加蓋容器中。當(dāng)酶液水分被聚乙二醇吸收而濃縮至5mL 左右時(shí)，

7、用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出濃縮液，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。(二)溶菌酶活力測(cè)定取上述各待測(cè)酶液稀釋3050倍，進(jìn)行酶活測(cè)定。用微量進(jìn)樣器取酶液樣品10L，加入0.5mL 的0.5mol/L 磷酸緩沖液(pH6.5)，混合均勻，37預(yù)熱2min，然后加入同樣已預(yù)熱過(guò)的菌懸液0.5mL。37保溫反應(yīng)15min 后，用2mL 乳化劑停止反應(yīng)。反應(yīng)液經(jīng)3000r/min 離心10min，取清液在721型分光光度計(jì)上進(jìn)行比色(540nm)?？瞻坠苡昧姿峋彌_液替代樣液。1.熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。2.掌握溶菌酶的提取及活力測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理溶菌酶又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶或N-乙酰

8、胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種堿性糖苷水解酶，能作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的粘多糖，具有殺菌等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床。溶菌酶存在于植物漿及動(dòng)物(蛋清、血漿、淋巴液和鼻粘膜等處)組織中，其中雞蛋清中含量較為豐富，且雞蛋清取材方便，因此實(shí)驗(yàn)室及實(shí)際生產(chǎn)中一般以雞蛋清為原料進(jìn)行溶菌酶的提取制備。從雞蛋清中分離溶菌酶可以選用多種不同的方法和步驟。本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化步驟為：等電點(diǎn)及熱變性選擇性沉淀聚丙烯酸處理葡聚糖凝膠柱層析聚乙二醇濃縮。溶菌酶具有耐熱性，在酸性條件下經(jīng)受長(zhǎng)時(shí)間高溫處理而不喪失活性；而且溶菌酶又具有特別高的等電點(diǎn)，因此采用熱變性與等電點(diǎn)沉淀相結(jié)合的方法可除去大部分的雜蛋白。聚丙烯酸是一種多聚蛋白質(zhì)，

9、在酸性條件下可以與溶菌酶結(jié)合形成凝聚物；當(dāng)有鈣離子存在時(shí)溶菌酶又能從這種凝聚物中分離出來(lái)，同時(shí)生成丙烯酸鈣沉淀，后者經(jīng)過(guò)硫酸的酸化又重新形成聚丙烯酸。在實(shí)驗(yàn)中，一旦提取液中溶菌酶與聚丙烯酸結(jié)合，所形成的凝聚物會(huì)立即粘附于試管的底部，傾去上層液體可使溶菌酶既得到純化，又得到濃縮。最后再用葡聚糖凝膠柱層析，使雜蛋白、溶菌酶和鈣離子分開(kāi)。三、儀器和試劑儀器玻璃層析柱(2.5cm×34cm)、電熱恒溫水浴鍋、離心沉淀機(jī)、10L 微量進(jìn)樣器、721型分光光度計(jì)。試劑1. Sephadex G-502. 1%NaCl0.05mol/LHCl3. 20%HAc4. 10%聚丙烯酸(現(xiàn)配現(xiàn)用)5.

10、0.5mol/LNa2CO36. 500g/LCaCl27. NaCl8. 6g/LNaCl9. 飽和草酸溶液；10. 細(xì)菌懸液：取1g 艷紅K-2BP 標(biāo)記的微球菌M.lysodeikticus 懸于100mL0.5mol/L 的pH6.5磷酸緩沖液中，置于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?1. 乳化劑：2g Brij-35(聚氧乙烯脂肪醇醚)加50mL 蒸餾水微熱使溶解，冷卻后定容至100mL。吸取此液10mL 用0.6mol/LHCl 定容至200mL 備用。12. 0.5mol/L 的pH6.5磷酸緩沖液。四、操作步驟(一)蛋清溶菌酶的分離提取1.變性與等電點(diǎn)選擇性沉淀：取新鮮蛋清用1%NaCl-0.

11、05mol/LHCl 溶液攪拌稀釋?zhuān)?0%HAc 調(diào)至pH4.6，3000r/min 離心10min，收集濾液并記錄體積，留樣2mL()待分析。將濾液置于沸水浴使3min 內(nèi)迅速升溫至75，用流動(dòng)水速冷后，3000r/min 離心20min，收集上清液，紀(jì)錄體積，并留樣2mL()待分析。2.丙烯酸處理：將所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量為清液體積的1/4)，慢速攪拌，當(dāng)凝聚物出現(xiàn)后，靜置30min 使凝聚物粘附于容器底部。傾去上清液，加入蒸餾水約1mL，并滴加少量0.5mol/LNa2CO3，使沉淀溶解，此時(shí)溶液pH6左右。攪拌條件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(體

12、積為聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀擠壓干后棄去。如所得溶液不夠澄清，可以進(jìn)行離心或簡(jiǎn)單過(guò)濾，并用少量水洗滌濾紙。收集濾液于刻度試管，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。3.Sephadex G-50 柱層析(1)裝柱：稱(chēng)取15g Sephadex G-50，加入300mL 蒸餾水溶脹6小時(shí)以上，置熱水浴中加熱除去氣泡，冷卻后裝入玻璃層析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡層析柱。(2)上樣：向樣液中加入固體NaCl 使終濃度為50g/L，上樣時(shí)先吸去層析柱凝膠面上的溶液，再沿管壁滴加樣品，樣品量不宜超過(guò)10mL。加完后打開(kāi)層析柱出口，讓樣品均勻流入凝膠內(nèi)。(3)洗脫：樣品流完后

13、，先分次加入少量6g/LNaCl 洗脫液洗下柱壁上的樣品，然后接通蠕動(dòng)泵，繼續(xù)6g/LNaCl 洗脫，調(diào)節(jié)操作壓力使流速控制在78mL/10min，部分收集器收集，10min 一管，共收集200mL 左右。(4)分析：紀(jì)錄各管體積，紫外光吸收法測(cè)定各管中蛋白質(zhì)濃度。合并含有蛋白質(zhì)的收集管，草酸鑒定Ca2+ ，留樣()待分析。4.乙二醇濃縮：將洗脫液放入透析袋，外面裹以聚乙二醇，置于加蓋容器中。當(dāng)酶液水分被聚乙二醇吸收而濃縮至5mL 左右時(shí)，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出濃縮液，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。(二)溶菌酶活力測(cè)定取上述各待測(cè)酶液稀釋3050倍，進(jìn)行酶活測(cè)定。用微量進(jìn)樣

14、器取酶液樣品10L，加入0.5mL 的0.5mol/L 磷酸緩沖液(pH6.5)，混合均勻，37預(yù)熱2min，然后加入同樣已預(yù)熱過(guò)的菌懸液0.5mL。37保溫反應(yīng)15min 后，用2mL 乳化劑停止反應(yīng)。反應(yīng)液經(jīng)3000r/min 離心10min，取清液在721型分光光度計(jì)上進(jìn)行比色(540nm)?？瞻坠苡昧姿峋彌_液替代樣液。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉溶菌酶的功能、分布以及作用特性。2.掌握溶菌酶的提取及活力測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理溶菌酶又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種堿性糖苷水解酶，能作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的粘多糖，具有殺菌等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床。溶菌酶存在于植物漿及動(dòng)物(蛋清、血漿、淋

15、巴液和鼻粘膜等處)組織中，其中雞蛋清中含量較為豐富，且雞蛋清取材方便，因此實(shí)驗(yàn)室及實(shí)際生產(chǎn)中一般以雞蛋清為原料進(jìn)行溶菌酶的提取制備。從雞蛋清中分離溶菌酶可以選用多種不同的方法和步驟。本實(shí)驗(yàn)采用的分離純化步驟為：等電點(diǎn)及熱變性選擇性沉淀聚丙烯酸處理葡聚糖凝膠柱層析聚乙二醇濃縮。溶菌酶具有耐熱性，在酸性條件下經(jīng)受長(zhǎng)時(shí)間高溫處理而不喪失活性；而且溶菌酶又具有特別高的等電點(diǎn)，因此采用熱變性與等電點(diǎn)沉淀相結(jié)合的方法可除去大部分的雜蛋白。聚丙烯酸是一種多聚蛋白質(zhì)，在酸性條件下可以與溶菌酶結(jié)合形成凝聚物；當(dāng)有鈣離子存在時(shí)溶菌酶又能從這種凝聚物中分離出來(lái)，同時(shí)生成丙烯酸鈣沉淀，后者經(jīng)過(guò)硫酸的酸化又重新形成聚丙

16、烯酸。在實(shí)驗(yàn)中，一旦提取液中溶菌酶與聚丙烯酸結(jié)合，所形成的凝聚物會(huì)立即粘附于試管的底部，傾去上層液體可使溶菌酶既得到純化，又得到濃縮。最后再用葡聚糖凝膠柱層析，使雜蛋白、溶菌酶和鈣離子分開(kāi)。三、儀器和試劑儀器玻璃層析柱(2.5cm×34cm)、電熱恒溫水浴鍋、離心沉淀機(jī)、10L微量進(jìn)樣器、721型分光光度計(jì)。試劑1.SephadexG-502.1%NaCl0.05mol/LHCl3.20%HAc4.10%聚丙烯酸(現(xiàn)配現(xiàn)用)mol/LNa2CO36.500g/LCaCl27.NaCl8.6g/LNaCl9.飽和草酸溶液；10.細(xì)菌懸液：取1g)待分析。將濾液置于沸水浴使3min內(nèi)迅速

17、升溫至75，用流動(dòng)水速冷后，3000r/min離心20min，收集上清液，紀(jì)錄體積，并留樣2mL()待分析。2.丙烯酸處理：將所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量為清液體積的1/4)，慢速攪拌，當(dāng)凝聚物出現(xiàn)后，靜置30min使凝聚物粘附于容器底部。傾去上清液，加入蒸餾水約1mL，并滴加少量0.5mol/LNa2CO3，使沉淀溶解，此時(shí)溶液pH6左右。攪拌條件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(體積為聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀擠壓干后棄去。如所得溶液不夠澄清，可以進(jìn)行離心或簡(jiǎn)單過(guò)濾，并用少量水洗滌濾紙。收集濾液于刻度試管，記錄體積，留樣0.5mL()待分析。3.SephadexG-50柱層析(1)裝柱：稱(chēng)取15gSephadexG-50，加入300mL蒸餾水溶脹6小時(shí)以上，置熱水浴中加熱除去氣泡，冷卻后裝入玻璃層析柱。用6g/LNaCl溶液200mL平衡層析柱。(2)上樣：向樣液中加入固體NaCl使終濃度為50g/L，上樣時(shí)先吸去層析柱凝膠面上的溶液，再沿管壁滴加樣品，樣品量不宜超過(guò)10mL。加完后打開(kāi)層析柱出口，讓樣品均勻流入凝膠內(nèi)。(3)洗脫：樣品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl洗脫液洗下柱壁上的樣品，然后接通蠕動(dòng)泵，繼續(xù)6g/LNaCl洗脫，調(diào)節(jié)操作壓力使流速控制在78mL/10min，部分收集器收集，10m