腸缺血再灌注損傷后內(nèi)毒素增敏作用及其機制的初步探討

1、    腸缺血再灌注損傷后內(nèi)毒素增敏作用 及其機制的初步探討        【摘要】目的探討腸缺血再灌注損傷(I/R)對內(nèi)毒素的增敏作用及其機制。方法大鼠腸系膜上動脈阻斷45 min后松夾進行再灌注，靜脈注射低劑量內(nèi)毒素(LPS，1.5 mg/kg)。觀察動物多臟器功能指標(biāo)及體外誘生腫瘤壞死因子(TNF)的改變。結(jié)果I/R+LPS組顯著加重全身血流動力學(xué)異常改變和肝、肺、腸等器官功能損害(P<0.01)。而單純LPS組或I/R組上述指標(biāo)改變較輕或無明顯異常。體

2、外試驗顯示，當(dāng)LPS刺激濃度10 ng/ml時，抗CD14單抗可顯著抑制全血TNF的誘生(P<0.050.01)，且I/R組抗CD14單抗對LPS誘導(dǎo)TNF的抑制率明顯高于傷前值或假手術(shù)組(P<0.050.01)。結(jié)論I/R可顯著提高機體對LPS攻擊的敏感性，其機理與體內(nèi)CD14依賴途徑的作用增強有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】腸缺血再灌注內(nèi)毒素抗體，CD14腫瘤壞死因子多器官功能障礙綜合征 The effect of intestinal ischemia/reperfusion on increased sensitivity to endotoxin and its potential me

3、chanismYAO Yongming,YU Yan,CHEN Jinsong,et al.Burn Institute,304 th Hospital of People's Liberation Army,Beijing 100037【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of intestinal ischemia/reperfusion injury (I/R)on increased sensitivity to endotoxin and its potential mechanism(s).MethodsSprague-D

4、awley rats underwent 45 minutes of superior mesenteric artery occlusion followed by reperfusion.Twelve hours after reperfusion,endotoxin (Escherichia coli LPS,1.5 mg/kg)was injected intravenously and rats were killed 12 hours later for measurement of organ function parameters.Also,in vitro study was

5、 performed to determine LPS-induced tumor necrosis factor (TNF)release in whole blood.ResultsLPS injection after I/R resulted in marked hemodynamic dysfunction and multiple organ damage(P<0.01)，while no significant or only minor changes in organ function parameters were observed in both I/R and L

6、PS groups.In whole blood,monoclonal antibody to CD14 significantly blocked the release of TNF at low LPS concentration(?10 ng/ml),and this response was dose dependent.Moreover,TNF release in LPS-stimulated whole blood obtained after I/R was inhibited to a significantly greater degree than that in ba

7、seline blood samples or sham-operation group(P<0.05-0.01).ConclusionSplanchnic artery occlusion followed by reperfusion could lead to increased sensitivity to the subsequent LPS challenge,which may be associated with a shift toward CD14-dependent mechanism(s).【Key words】Intestinal ischemia/reperf

8、usion EndotoxinAntibody,CD14Tumor necrosis factor Multiple organ dysfunction syndrome腸缺血再灌注損傷(I/R)是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷后常見的病理生理過程，是導(dǎo)致膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要誘發(fā)因素之一1，2。有資料顯示，MODS的發(fā)生與I/R顯著增強機體對內(nèi)毒素的敏感性有關(guān)2，但其確切機理尚不清楚。近年來的研究表明，CD14是內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)結(jié)合的功能受體，它與脂多糖結(jié)合蛋白(LPS-binding protein,LBP)共同構(gòu)成機體內(nèi)毒素一系列生物效應(yīng)的重要增敏系統(tǒng)3。因此，了解CD1

9、4在I/R后內(nèi)毒素增敏效應(yīng)中的作用，將有助于進一步闡明創(chuàng)、燒傷后器官損害的發(fā)病機理。我們采用大鼠急性I/R模型，初步探討了CD14在介導(dǎo)內(nèi)毒素所致炎癥反應(yīng)及器官損害中的意義。1材料與方法1.1動物模型及分組1.2觀察指標(biāo)及方法41.3統(tǒng)計學(xué)處理各項均數(shù)以±s表示，應(yīng)用SAS統(tǒng)計軟件包進行t檢驗及方差分析等。2結(jié)果2.1腸缺血再灌注后內(nèi)毒素攻擊對器官功能及血漿LPS水平的影響如表1所示，I/R組或LPS組MAP、CI、SV與假手術(shù)組相近或僅輕度下降，I/R+LPS組的血流動力學(xué)異常改變則顯著加重(P<0.01)。除血清BUN以外，反映器官功能的指標(biāo)如ALT、D-乳酸、肺毛細(xì)血管通

10、透性等在I/R+LPS組改變最重，其升高幅度均明顯大于I/R組或LPS組(P<0.01)。單純LPS攻擊組無明顯器官功能損害或呈一過性改變，上述諸多指標(biāo)基本穩(wěn)定于傷前范圍或輕度升高。此外，I/R+LPS組血漿LPS均值為1 047.6 pg/ml,顯著高于I/R組(25.3 pg/ml,P<0.01)及LPS組(257.8 pg/ml,P<0.01)。表1大鼠腸缺血再灌注后內(nèi)毒素對器官功能指標(biāo)的影響(±s)Tab 1Effects of intestinal ischemia/reperfusion combined with endotoxin challenge

11、 on organ function parameters(±s)組別MPA(kPa)CI(mlmin-1kg-1)SV(mlbeat-1)ALT(nmolS-1L-1)BUN(mmolL-1)D-乳酸(molL-1)肺血管通透性(gg-1)S組13.30±0.53403±170.61±0.09606.8±68.38.25±1.7646.8±4.043.1±10.6I/R組12.37±1.20364±28*0.56±0.12830.2±198.4*24.50±4.8

12、0*66.3±29.3106.1±35.2*LPS組13.83±1.73391±330.59±0.07668.5±146.713.60±3.40*43.5±8.365.9±17.6*I/R+LPS組9.04±1.86*265±39*0.52±0.141638.7±341.7*22.30±6.70*135.8±44.8*255.8±87.3*與S組比較：*P<0.05，*P<0.012.2腸缺血再灌注對內(nèi)毒素體外誘導(dǎo)TNF產(chǎn)生

13、的影響在全血中，隨著LPS刺激劑量的增大，TNF產(chǎn)生不斷增多，無論是S組還是I/R組均呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性反應(yīng)(表2)。LPS濃度10 ng/ml時，抗CD14單抗可顯著抑制全血TNF的產(chǎn)生(P<0.050.01)；但當(dāng)LPS濃度100 ng/ml時，其誘導(dǎo)TNF的產(chǎn)生受CD14單抗的影響較小。僅I/R組12 h應(yīng)用CD14單抗可部分減少TNF的釋放(P<0.05)。2.3抗CD14單抗對內(nèi)毒素誘導(dǎo)TNF抑制率的影響由表3可見，I/R后抗CD14單抗對內(nèi)毒素誘導(dǎo)TNF的抑制效應(yīng)明顯增強，當(dāng)LPS濃度10 ng/ml時其抑制率顯著高于傷前值或S組(P<0.050.01)。而S組

14、手術(shù)前后不同LPS刺激濃度時TNF抑制率改變不明顯(P>0.05)。3討論動物實驗與臨床觀察表明，內(nèi)毒素血癥與嚴(yán)重創(chuàng)、燒傷后一系列并發(fā)癥，如膿毒癥、MODS等密切相關(guān)5。然而，急性損傷后循環(huán)中內(nèi)毒素含量常處于較低水平，因此有人推測體內(nèi)細(xì)菌內(nèi)毒毒的增敏效應(yīng)可能是介導(dǎo)繼發(fā)性打擊、誘發(fā)致死性并發(fā)癥的重要環(huán)節(jié)6。但至今仍缺乏足夠的、令人信服的證據(jù)。本實驗結(jié)果顯示，I/R復(fù)合低劑量內(nèi)毒素(1.5 mg/kg)攻擊可顯著加重動物全身血流動力學(xué)障礙及肝、肺、腸道等多個器官損害。同時，機體對內(nèi)毒素的清除能力下降，呈現(xiàn)明顯的內(nèi)毒素血癥。但單純內(nèi)毒素(3.0 mg/kg)組動物血流動力學(xué)參數(shù)及肝、腸、腎等臟

15、器功能無明顯損害或僅呈輕度異常改變。該結(jié)果提示，I/R可顯著提高機體對內(nèi)毒素攻擊的敏感性，從而為繼發(fā)性打擊導(dǎo)致膿毒癥或MODS起了“預(yù)激”(Priming)作用2，6。有資料表明，I/R、失血性休克、燒傷等多種外科應(yīng)激情況均可增加宿主對細(xì)菌及其毒素的易感性，使機體單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞處于致敏狀態(tài)2，6，7。據(jù)報道，腸系膜上動脈夾閉后，注射內(nèi)毒素能明顯增加肺組織中性粒細(xì)胞聚集和血管通透性，且動物死亡率顯著上升2。這與我們的觀察基本相符，說明I/R等原發(fā)性打擊可有效激發(fā)體內(nèi)炎癥細(xì)胞活化。內(nèi)源性內(nèi)毒素或細(xì)菌大量入侵則可進一步通過增敏系統(tǒng)誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，最終造成多臟器功能損害甚至衰竭1，5，

16、6。表2腸缺血再灌注對內(nèi)毒素體外誘導(dǎo)TNF產(chǎn)生的影響(pg/ml,±s)Tab2Effects of intestinal ischemia/reperfusion on endotoxin-induced tumor necrosis factor release in vitro(pg/ml,±s)組別LPS刺激劑量(ng/ml)0110100S組傷前全血34±5157±42881±3321106±418傷前+CD14單抗28±975±29*405±78*849±22612 h全血41

17、77;12149±53742±183978±24612 h+CD14單抗32±786±35*387±105*655±401I/R組傷前全血45±28126±41789±235962±385傷前+CD14單抗37±672±38392±114*730±29812 h全血63±31173±64961±159725±25812 h+CD14單抗48±2535±19*87±42*404&

18、#177;161*分別與傷前或12 h全血比較：*P<0.05，*P<0.01表3抗CD14抗體對內(nèi)毒素誘生TNF抑制率的影響(%，±s)Tab3Inhibitory effects of monoclonal antibody to CD14 on endotoxin-stimulated tumor necrosis factor formation in whole blood(%,±s)組別LPS刺激劑量(ng/ml)0110100S組傷前17.8±3.552.6±16.254.5±17.723.4±8.112 h

19、22.4±5.942.1±15.547.8±12.333.5±14.4I/R組傷前17.6±7.442.9±17.350.8±14.724.4±9.912 h23.7±11.880.8±32.5?#90.4±17.9*#44.3±16.6與傷前值比較：*P<0.05，*P<0.01；與S組比較：#P<0.05，#P<0.01關(guān)于I/R增敏內(nèi)毒素作用的機制尚不清楚，推測可能與機體識別和調(diào)控內(nèi)毒素效應(yīng)的LBP/CD14系統(tǒng)有關(guān)。許多體外觀察證明，LBP/C

20、D14系統(tǒng)能明顯提高多種細(xì)胞對內(nèi)毒素的敏感性，可使其生物學(xué)活性提高數(shù)百倍甚至數(shù)千倍3。為了選擇合適的抗CD14抗體使用劑量，在預(yù)試驗中，我們觀察分別加入不同濃度抗CD14單抗(1，5，10，25 g/ml)對LPS(10g/ml)刺激TNF誘生的影響。發(fā)現(xiàn)無論是S組還是I/R組，在全血中隨著抗CD14單抗?jié)舛仍龈?110 g/ml)，TNF誘生抑制率均呈明顯的劑量依賴關(guān)系。但當(dāng)抗CD14單抗?jié)舛仍鲋?5 g/ml時，其抑制反應(yīng)未見進一步提高，提示本試驗所用10g/ml單抗?jié)舛纫堰_(dá)飽和劑量。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)毒素濃度10 ng/ml時，抗CD14單抗可明顯抑制全血釋放TNF；但當(dāng)內(nèi)毒素濃度100

21、 ng/ml時，其誘導(dǎo)TNF的產(chǎn)生受抗CD14單抗的影響不大。由此可見，CD14介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)與內(nèi)毒素刺激劑量密切相關(guān)。它們僅能在內(nèi)毒素低濃度時起增敏效應(yīng)，在較高濃度時內(nèi)毒素可通過非CD14依賴途徑發(fā)揮其毒性作用。由于I/R后循環(huán)內(nèi)毒素含量常處于較低水平(一般在1 ng/ml以下)，因此CD14在介導(dǎo)內(nèi)毒素血癥誘發(fā)過度炎癥反應(yīng)及臟器損害中可能發(fā)揮了強大的增敏作用8。這樣，嚴(yán)重創(chuàng)、燒傷早期使用CD14抗體可阻斷內(nèi)毒素血癥的有害反應(yīng)，從而可能防止MODS的發(fā)生與發(fā)展。進一步分析發(fā)現(xiàn)，I/R后抗CD14對內(nèi)毒素誘導(dǎo)TNF產(chǎn)生的抑制效應(yīng)明顯增強，當(dāng)內(nèi)毒素劑量10 ng/ml時抑制率顯著高于傷前基礎(chǔ)值

22、。同時，內(nèi)毒素刺激全血產(chǎn)生TNF的能力亦有所提高。該結(jié)果表明，I/R后內(nèi)毒素刺激全血產(chǎn)生TNF主要依賴于CD14，且體內(nèi)CD14依賴途徑的作用明顯增強。最近，有人在兔失血性休克模型中觀察到，休克前給予CD14抗體并不影響TNF的產(chǎn)生，但休克后24，72 h后它可有效阻斷體外細(xì)胞因子的誘生9。因此，I/R、燒傷或失血性休克打擊可進一步激活內(nèi)毒素增敏系統(tǒng)。但其詳細(xì)機制目前尚不清楚，推測與急性損傷后機體CD14表達(dá)的上調(diào)有關(guān)?？傊?，我們的實驗結(jié)果提示，I/R可顯著提高動物對內(nèi)毒素攻擊的敏感性，該效應(yīng)與體內(nèi)CD14依賴途徑的作用增強有關(guān)。關(guān)于嚴(yán)重創(chuàng)、燒傷后內(nèi)毒素血癥誘發(fā)多臟器損害病理過程中CD14的確

23、切作用及其調(diào)控機制有待于進一步探討。(志謝：本研究得到奧地利Ludwig Boltzmann創(chuàng)傷研究所Natmessnig BE博士及德國Borstel醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究所Rietschel ET教授的大力支持與幫助。)本文受全軍“九五”醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金、中國工程科技獎助基金及奧地利科學(xué)發(fā)展促進會基金資助作者單位：姚詠明于燕盛志勇北京，解放軍第三四醫(yī)院燒傷研究所基礎(chǔ)部100037陳勁松解放軍第一八七醫(yī)院燒傷科Redl H,Schlag G奧地利維也納Ludwig Boltzmann創(chuàng)傷研究所參考文獻1Yao YM,Sheng ZY,Yu Y,et al.The potential etiolog

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