堿性成纖維細胞生長因子在低氧大鼠肺動脈的表達及其對肺動脈張力的影響

1、    堿性成纖維細胞生長因子在低氧大鼠肺動脈的 表達及其對肺動脈張力的影響        摘要目的：觀察堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）在低氧性肺動脈高壓發(fā)病中的可能作用。方法：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)觀察低氧大鼠肺動脈bFGF的表達水平，并觀察bFGF對離體大鼠肺動脈環(huán)收縮功能的影響。結(jié)果：低氧時，肺動脈bFGF mRNA表達明顯增加，bFGF與-actin的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物的放射強度（counts*min-150 為2.62×

2、10-7mol/L。結(jié)論：提示bFGF可能參與低氧性肺動脈高壓的發(fā)病過程。主題詞成纖維細胞生長因子，堿性；肺動脈；大鼠；低氧中分類號R543.2文獻標識碼A文章編號1000-4718(2000)06-0549-03 Expression of bFGF mRNA in pulmonary artery of rat with chronic hypoxia and its effect on tension of rat pulmonary artery in vitroRAN Pi-xin, CHEN Shun-cun(Guangzhou Institute of Respiratory D

3、isease, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182, China)NIE Sheng-li(The Second Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences)CHEN Yan-fang(Guangdong Provincial Hospital)AbstractAIM: To explore the role of basic-fibroblast growth factor (bFGF) in the development of pulmonary hyp

4、ertension induced by hypoxia. METHODS: 1) The pulmonary arteries of SD rats with hypoxia for one and two weeks were isolated, from which the total RNA were extracted by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorform .Then the levels of mRNA were measured by RT-PCR. 2) About 3mm-long arterial rings cu

5、t from SD rat pulmonary arterial stem were suspended between stainless steelhooks in chamber with warmed (37) Kreb's solution. Different concentrations of bFGF were added in a cumulative fashion into the chamber where the rings were suspended. The cumulative concentration response curve was obta

6、ined. RESULTS: 1)The levels of bFGF mRNA in pulmonary artery of rats with hypoxia were increased significantly compared with those that without hypoxia (2578±384 counts*min-1 (control) vs 5303±756 (hypoxia) for 1 week and 4054±547 (hypoxia) for 2 weeks, P all 0.05). 2) bFGF at concent

7、rations ranged from 5.56×10-102.78×10-7mol/L caused dose-dependent contraction of vessel rings of rat pulmonary artery (r=0.695,P0.05), with EC50 being 2.62×10-7mol/L. CONCLUSION: bFGF may play an important role in the hypoxic pulmonary hypertension.MeSHFibroblast growth factor, basic

8、; Pulmonary artery; Rats; Anoxia肺小動脈結(jié)構(gòu)改建是慢性低氧性肺動脈高壓的主要病理特征。一些生長因子和癌基因可能與該改建過程相關(guān)1，2。 堿性成纖維細胞生長因子（basic-fibroblast growth factor, bFGF）作為主要的促血管生長因子之一，其能促進內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞的增生3，我們以前用免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)低氧兩周時，肺血管壁bFGF的陽性染色顆粒明顯多于對照組，故推測bFGF也可能參與肺血管的改建過程4 。本實驗用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)進一步觀察低氧對大鼠肺動脈壁表達bFGF mRNA的影響，同時觀察bFGF對肺血管收

9、縮的作用，以探討它在低氧性肺血管收縮過程中的作用。材料和方法一、大鼠肺動脈壁bFGF檢測（一）動物來源及低氧方法體重250300 g雄性SD 大鼠30只（廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)用實驗動物廠提供），隨機分成對照組，低氧1周組和低氧2周組，每組各10只。低氧大鼠置于自制常壓低氧箱內(nèi)，調(diào)節(jié)箱內(nèi)氧濃度為10%，每天低氧8 h，對照組除不給低氧外，其它飼養(yǎng)條件與低氧組相同。（二）標本取材及處理處死動物開胸取出心肺，小心分離肺動脈，立即置液氮內(nèi)凍存待用。實驗用所有器皿均在泡酸沖洗后于180干烤8 h以上或以DEPC水在37處理12 h，再高溫高壓消毒。（三）細胞總RNA提取按文獻報道之異硫氰酸胍法提取肺動脈壁總R

10、NA5 。（四）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用美國promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按盒內(nèi)說明書操作：在4按下列順序取各試劑加入滅菌的EP管中：25 mmol/L MgCl2 4 L 、10×緩沖液2 L,10 mmol/L dNTP混合物2 L、RNase抑制劑20 L、15-寡聚胸腺嘧啶核苷酸0.1 g 、禽源反轉(zhuǎn)錄酶20 U、總RNA 4 L，加水至總體積20 L，于42水浴60 min，反轉(zhuǎn)錄完成后再95水浴中加熱10 min，滅活A(yù)MV反轉(zhuǎn)錄酶，終止反應(yīng)。(五) 定量PCR本實驗所用引物由上海細胞所合成。引物序列為：-actin：5-ATCTGACACCACACCTTCTACAATGAGC

11、TGCG-3；5-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3，由該對引物可擴增出一長度為838bp的-actin片段。bFGF6：5-GTATGAAACGGCGGCTTCTT-3，5-TGAGTCAGCTCTTAGCAGAC-3，用這對引物擴增出的bFGF片段長度為364 bp。-actin擴增反應(yīng)步驟如下：在4時依次向無菌EP管中加入10×PCR緩沖液5 L，上、下游引物各1 L， Taq酶1.25 U，混合dNTP 2 L、逆轉(zhuǎn)錄混合產(chǎn)物4 L、 -32P dCTP0.1 Ci，加水至50 L。變性、退火與延伸條件分別為90 1 min 、50 1 min

12、 、70 1 min，共30個循環(huán)，最后72 延伸10 min 后4保存。bFGF的擴增反應(yīng)步驟為：依次于無菌EP管中加入：10×PCR緩沖液5 L，上、下游引物各1 L，dNTP混合物4 L，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 L，-32P dCTP 0.37×104 Bq，加水至50 L；反應(yīng)條件為變性94 1 min ，退火50 1 min ， 延伸70 1 min，共30個循環(huán)，最后72延伸10 min，4保存。反應(yīng)完畢取10 L 擴增產(chǎn)物行1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下切取含有PCR產(chǎn)物的凝膠條帶，用液體閃爍計數(shù)儀檢測擴增物中32P的放射強度（counts*min-1）。二、大鼠肺

13、動脈環(huán)離體收縮實驗（一） 主要儀器與試劑bFGF為Sigma公司產(chǎn)品，Kreb氏液購自市售商店。八道生理記錄儀為日本光電公司產(chǎn)品。（二） 實驗動物與標本制備斷頭處死體重300350 g 的雄性SD大鼠，制成長約3 mm 的血管環(huán)，置入盛37 Kreb氏液的浴槽內(nèi)，能通入95%O2-5% CO2 混合氣體，平衡備用。（三）肺血管收縮反應(yīng)讓血管環(huán)在最佳靜息張力800 mg下穩(wěn)定1 h，其間每隔15 min更換1次新鮮Kreb氏液，以張力傳感器、八道生理記錄儀等記錄血管環(huán)的張力。按累積法給予bFGF，先從閾濃度開始，待出現(xiàn)收縮平臺后，又給予既定劑量的bFGF，記錄血管環(huán)張力變化。結(jié)果一、低氧大鼠肺動

14、脈bFGF的表達低氧時SD大鼠肺動脈壁bFGF mRNA表達明顯高于對照組，表1。表1大鼠肺動脈RT-PCR產(chǎn)物放射性強度Tab 1 The radio-strength of RT-PCR product of ratpulmonary artery (±s,n=10）Group bFGF (counts.min-1)-actin (counts.min-1)bFGF/-actin (%)Control 2578±384 5081±287 50.74Hypoxia 1 week5303±756*5375±253 91.82*Hypoxia 2

15、 weeks 4054±547*5197±207 78.12* *P0.05， vs control 二、bFGF對大鼠肺動脈的收縮作用bFGF能引起大鼠離體肺動脈環(huán)的收縮，在濃度5.56×10-102.78×10-7mol/L時，其收縮強度與劑量呈正相關(guān)(r=0.695,P0.05),其EC50為2.62×10-7mol/L， 1。 Fig 1The effect of bFGF on tension of the pulmonary arterial rings of rat in vitro (n=5, r=0.695, P0.05)1b

16、FGF對離體大鼠肺血管環(huán)收縮功能的影響討論堿性成纖維細胞生長 因子（bFGF）刺激成纖維細胞及平滑肌細胞增殖的功能很強。成纖維細胞、平滑肌細胞、T淋巴細胞及神經(jīng)細胞等均可產(chǎn)生bFGF。我們以前用免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)，低氧大鼠肺組織內(nèi)bFGF陽性染色物質(zhì)明顯多于非低氧對照組4。本實驗用RT-PCR方法證實低氧可促進大鼠肺動脈bFGF mRNA的表達增加，根據(jù)bFGF的致分裂特性，我們認為它在低氧性肺血管結(jié)構(gòu)的重建中可能起一定作用。業(yè)已證明，低氧性肺動脈高壓的發(fā)病包含有兩個重要的發(fā)病環(huán)節(jié)，即低氧性肺血管收縮反應(yīng)和血管重建。除一系列生長因子直接刺激肺動脈細胞成分分裂增殖外，持續(xù)的血管收縮也可引起血

17、管壁的適應(yīng)性增殖。因此，本實驗還觀察了bFGF對肺血管收縮功能的作用，發(fā)現(xiàn)bFGF能收縮大鼠離體肺動脈環(huán)。提示bFGF可能參與低氧性肺動脈高壓發(fā)病的兩個環(huán)節(jié)。基金項目 廣州市計委重大攻關(guān)項目(編號951030)冉丕鑫（廣州醫(yī)學(xué)院附一院廣州呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510182）聶勝利（中山醫(yī)科大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院）陳顏芳（廣東省人民醫(yī)院心研所）陳順存（廣州醫(yī)學(xué)院附一院廣州呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510182）參考文獻1冉丕鑫，鐘南山. 生長因子、原癌基因與低氧性肺動脈高壓J. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1996，16（1）：15. 2Demiryurek AT, Wadsworth RM, Kane

18、 KA, et al. The role of endothelium in hypoxic constriction of human pulmonary artery ringsJ. Am Res Respir Dis, 1993,147:283287. 3Slavin I. Fibroblast growth factors: At the heart of angiogenesisJ. Cell Biol Int, 1995,19:431435. 4歐陽能太，冉丕鑫，杜志強，等. 缺氧對大鼠肺組織成纖維細胞生長因子和c-myc癌基因表達的影響J. 中華結(jié)核和呼吸雜志，1997，20（1）：2224. 5Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid quanidin