鐵脂質(zhì)體的制備及其體外釋放研究

1、 第 41卷 /第 1期 /2017年 1月 河北師范大學(xué)學(xué)報(bào) /自然科學(xué)版 /JOURNAL OF HEBEI NORMAL UNIVERSITY /Natural Science Edition /Vol41No1Jan2017文章編號(hào) :10005854(2017 01005806收稿日期 :20150526; 修回日期 :20151211基金項(xiàng)目 :國(guó)家自然科學(xué) 青年 基金 (31201305 ; 河北 省自然科學(xué)基金 石藥 集 團(tuán) 醫(yī) 藥 聯(lián) 合研究基金 (C2012205082作者簡(jiǎn)介 :李 妮娜 (1990 , 女 , 河北 衡 水 人 , 碩 士研究生 , 研究方向?yàn)?功 能

2、納米脂 質(zhì) 體的 制 備 及 應(yīng)用 通 信 作者 :耿 麗 娜 (1976 , 女 , 副教授 , 碩 士生 導(dǎo) 師 , 研究方向?yàn)?載 藥 脂 質(zhì) 體 Email :genglina0102126com 鐵脂質(zhì)體的制備及其體外釋放研究李妮娜 1, 李亞永 2, 王 琳 1, 常彥忠 3, 耿麗娜1(1河北師 范 大學(xué) 化學(xué)與 材 料科學(xué)學(xué)院 , 河北 石 家 莊 050024; 2石 家 莊 市 第 一 醫(yī) 院 內(nèi) 科 , 河北 石 家 莊 050000;3河北師 范 大學(xué) 生 命 科學(xué)學(xué)院 , 河北 石 家 莊 050024摘 要 :鐵 是 人 體 必需 的 微 量 元素 之 一 , 鐵缺

3、乏會(huì) 導(dǎo)致 貧 血 等 疾病 ,而 常 規(guī)補(bǔ)鐵 劑 具有 吸 收率 低 、 有 毒 性 等 缺 點(diǎn) 采 用 薄膜旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 法 和 乙 醇 注 入 法 , 成 功 制 備 了 檸檬 酸 鐵脂 質(zhì) 體 (FAClip 和 血 紅素 鐵脂 質(zhì) 體 (HEMElip 采 用動(dòng) 態(tài) 光 散 射 (DLS 、 透 射 電 鏡 (TEM 對(duì) 鐵脂 質(zhì) 體進(jìn)行 了 表征 , 并進(jìn)行體外 釋 放 研究 結(jié)果表明 ,鐵脂 質(zhì) 體 都呈 球 形 、 具有連 續(xù)膜 結(jié)構(gòu) 和 緩 釋 性 , 且 藥 物 的分子 量 、 結(jié)構(gòu) 、 與 膜 層 作 用 力 及 脂 質(zhì) 體的 粒徑 大 小 對(duì) 脂 質(zhì) 體的 藥 物 釋

4、 放都有 影響 關(guān)鍵詞 :檸檬 酸 鐵 ; 血 紅素 鐵 ; 脂 質(zhì) 體 ; 體外 釋 放 ; 緩 釋 性中圖分類(lèi)號(hào) :R 94文獻(xiàn)標(biāo)志碼 :A doi :1013763/jcnkijhebnunse201701011Preparation and in Vitro Release Study of Iron LiposomesLI Nina 1, LI Yayong 2, WANG Lin 1, CHANG Yanzhong 3, GENG Lina 1(1College of Chemistry and Material Sciences , Hebei Normal University

5、 , Hebei Shijiazhuang 050024, China ;2Department of Internal Medicine , the First Hospital of Shijiazhuang , Hebei Shijiazhuang 050000, China ;3College of Life Science , Hebei Normal University , Hebei Shijiazhuang 050024, China Abstract :Iron is one of the essential trace elements of all organisms

6、and iron deficiency can lead to anemia , but the conventional iron agents have many disadvantages , such as low efficacy and certain toxicityIn this study , ferric citrate liposomes (FAClip and heme liposomes (HEMElip are prepared successfully by rotaryevaporated filmultrasonication method and ethan

7、ol injection methodThe prepared iron liposomes are characterized by dynamic light scattering (DLS and transmission electron microscope (TEM and studied the release in vitroThe results showed that iron liposomes are all spherical shape and had continous membranesMeanwhile , the iron liposomes have co

8、ntrolledrelease properties , and the molecular mass and structure of drugs and the particle sizes of liposomes all can affect the release in vitroKey words :FAC ; HEME ; liposome ; release in vitro ; control release鐵 是 人 體 必需 的 微 量 元素 之 一 , 在 機(jī) 體 活 動(dòng)和生物 代謝 中 起 著 非 常 重 要 的作 用 目 前 , 鐵缺乏癥 是 全 球性 營(yíng) 養(yǎng) 缺乏

9、 疾病 , 全 世界 約 有 20多 億 人 存 在 不同 程 度 的 鐵缺乏癥 , 11多 億 人 患缺鐵 性 貧 血 , 世界衛(wèi) 生 組織已 將 缺鐵 性 貧 血 列 為 全 球 四 大 營(yíng) 養(yǎng) 性 疾病 之 一12鐵缺乏癥 通 常是 由于 攝 入 含 鐵 食 物 不 足 、 對(duì) 食 物中 鐵 的 利 用 度 低 或鐵消耗 過(guò)多 造 成 的34, 因 此 口 服補(bǔ)鐵 劑 或增 加 食 物中 鐵 含 量是 預(yù)防鐵缺乏癥 最好 的 可 持 續(xù) 發(fā) 展 的 方 法 57目 前 , 常 用 的 補(bǔ)鐵 劑 主要 是 小 分子有 機(jī) 酸 鐵 鹽 , 如 葡萄 糖 酸 亞 鐵 、 檸檬 酸 鐵 、血 紅

10、素 鐵 、 乙 二胺四 乙 酸 鐵鈉 等 , 一 般 通過(guò) 口 服 方 式 進(jìn)行 補(bǔ)鐵 , 但 存 在 口 感 差 、 副 作 用大 、 吸 收率 低 、 有 毒 性 等 缺 點(diǎn) 8, 同 時(shí) 檸 檬 酸 鐵 和 血 紅素 鐵 對(duì) 光 和熱 敏 感 , 不 穩(wěn)定 , 因 此 , 尋找 一種 新 的 治療 缺鐵 性 貧 血 的 補(bǔ)鐵 劑 勢(shì) 在 必 行 脂 質(zhì) 體 (liposome 是近年來(lái) 出 現(xiàn) 的一種 新 型 藥 物 載 體 , 具有 類(lèi) 細(xì) 胞的 雙 分子 層 結(jié)構(gòu) , 無(wú) 毒 、 無(wú) 免疫 原 , 可 作 為 親 水 性 、 疏 水 性 或 是 兩 性 物 質(zhì) 的 載 體910, 用

11、 于 藥 物 、 質(zhì) 粒 、 多 肽 、 蛋白 、 病 毒 、 細(xì)菌 等 1112多種 物 質(zhì) 的 載 運(yùn) , 還 具有 靶 向 性 、 低 毒 性 、 生物 可降解 性 、 增 溶 難 溶物和 長(zhǎng) 效 緩 釋 性 等 優(yōu) 點(diǎn) 13, 在 藥 物 載 體 中 脫 穎 而 出 在 筆者前 期 實(shí)驗(yàn) 的 基 礎(chǔ) 上 14, 本文 以 脂 質(zhì) 體作 為 常 規(guī)補(bǔ)鐵 劑 的 載 體 , 采 用 薄膜旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 法 和 乙 醇 注 入 法制 備 鐵脂 質(zhì) 體 , 通過(guò) 優(yōu) 化 卵磷脂 /膽 固 醇 、 藥 物 /卵磷脂 的 比 例 及 超 聲 時(shí) 間 , 制 備 出 包封率 高 的 鐵脂 質(zhì) 體 ;

12、 采 用動(dòng) 態(tài) 光 散 射 、 透 射 電 子 顯微 鏡 (TEM 等 技術(shù) 對(duì) 鐵脂 質(zhì) 體進(jìn)行表征 , 并 考 察 了 藥 物 分子 大 小 、 脂 質(zhì) 體 粒徑 大 小 對(duì) 載 藥 脂 質(zhì) 體體外 釋 放 的 影響 1材料 與 方法 11材料與主要設(shè)備 111實(shí)驗(yàn) 材 料水 溶 性 檸檬 酸 鐵 (FAC , 美 國(guó) Sigma 公司 ,水 溶 性 血 紅素 鐵 (HEME , 和 田龍 生物科 技 公司 , 大 豆卵磷脂 (北 京 華 美 磷脂 科 技 有 限公司 , 膽 固 醇 (北 京 鼎 國(guó)生物 技術(shù) 發(fā) 展 中 心 ; 其 他試 劑 均 為 分析 純 (生物科 技 發(fā) 展 有

13、限公司 112儀 器 與 設(shè)備U 3010紫 外 可見(jiàn) 分光光 度 計(jì) (日 本 日 立 公司 ,CPS2超 聲 波 粉 碎 機(jī) (寧 波 新 芝 超 聲 有 限公司 , 852恒 溫 磁 力 攪拌器 (常 州 澳華 儀 器 有 限公司 ,TGL 18B 高 速 離 心 機(jī) (湖南星 科科學(xué) 儀 器 有 限公司 , ZHWY 200B 恒溫 培 養(yǎng) 振 蕩 器 (上 海 智誠(chéng) 分析 儀 器 制 造 有 限公司 , 微 量 移 液器 (德 國(guó) Eppendorf 公司 ,JEM100SX 透 射 電 子 顯微 鏡 (日 本 日 立 公司 ,ZetaSizer Nano ZS (英 國(guó) 馬 爾 文

14、公司 12實(shí)驗(yàn)方法 121薄膜旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 法制 備 FAClip1和 HEMElip 13按 比 例 稱取 大 豆卵磷脂 和 膽 固 醇 (質(zhì) 量 比 分 別 為 8 1, 10 1, 12 1 , 溶 于 10mL 無(wú) 水 乙 醇 中 , 置 于 旋轉(zhuǎn) 蒸 發(fā)儀 上 45 真 空 旋 轉(zhuǎn) 成 膜 取 檸檬 酸 鐵 (血 紅素 鐵 的 PBS 溶 液 10mL ,倒 入 上述 成 膜 的 圓底燒瓶 中 , 旋 轉(zhuǎn) 40min , 直 至 成為 均 勻 的 混 懸 液 分 別 超 聲 處 理 10, 15, 20min , 將處 理 后 的 混 懸 液置 于 透 析 袋 中 (MWCO350

15、0 純 化 , 避 光 透 析 4 5h將所得 產(chǎn) 物 置 于 4 冰 箱 中 , 保 存 備 用 122乙 醇 注 入 法制 備 FAClip2按 比 例 稱取 大 豆卵磷脂 和 膽 固 醇 (質(zhì) 量 比 分 別 為 4 1, 6 1, 8 1, 10 1 , 溶 于 2mL 無(wú) 水 乙 醇 中 將 盛有 8mL 檸檬 酸 鐵 溶 液 的 燒杯 置 于 水 浴 中 , 邊 攪拌 邊勻 速 滴 加 卵磷脂 和 膽 固 醇的 混 合 液 ,直 至 乙 醇 揮 發(fā) 完 全 , 即 可得 到 FAClip2分 別 超 聲 處 理 5, 10, 15, 30min , 將處 理 后 的 混 懸 液置

16、于 透 析 袋 中 (MWCO 3500 純 化 , 避光 透 析 4 5h將所得 產(chǎn) 物 置 于 4 冰 箱 中 , 保 存 備 用 123脂 質(zhì) 體 包封率 的測(cè)定準(zhǔn)確稱取 檸檬 酸 鐵 (血 紅素 鐵 標(biāo)準(zhǔn) 品 , 配 置 一系 列 濃 度 的 標(biāo)準(zhǔn) 溶 液 , 用 紫 外 分光光 度 計(jì) 分 別 測(cè) 試 其 在 260nm (393nm 處 的 吸 光 度 , 得 到 檸檬 酸 鐵 和 血 紅素 鐵 的 工 作 曲 線分 別是 :A =1296C 007299(R =09994 和 A =5794C 008084(R =09992 取 1mL FAC lip (HEMElip 于 10

17、mL 離 心 管 中 , 加入 1mL 的 二甲苯 破乳 , 充分 混 勻 后 , 先 用 3500g 離 心 20min , 再 用 4000g 離 心 10min棄 去 上 清 , 下 層 即 為 檸檬 酸 鐵 (血 紅素 鐵 溶 液 用 紫 外 可見(jiàn) 分光光 度 計(jì) 分 別 測(cè) 試 260nm (393nm 處 的 吸 光 度 , 再 代 入 工 作 曲 線 , 即 可得 到 脂 質(zhì) 體 所包封 的 檸檬 酸 鐵 (血 紅素 鐵 的 量 然 后 根 據(jù) 公式 (1 計(jì) 算 , 得 到 鐵脂 質(zhì) 體的 包封率 (EE% 包封率 =脂 質(zhì) 體 中 包封 的 藥 物 量 /反 應(yīng)中 所加入 的

18、 藥 物 總 量 100%(1124鐵脂 質(zhì) 體的形 態(tài) 和 粒徑 分 布 測(cè)定 用 滴 管 吸取 1滴 經(jīng) 稀 釋 的 鐵脂 質(zhì) 體 , 滴 在 鍍 膜 的 銅 網(wǎng)表面 , 自然 晾干 , 再 用 質(zhì) 量 分?jǐn)?shù) 為 4%磷 鎢 酸溶 液 對(duì) 脂 質(zhì) 體進(jìn)行 負(fù)染 , 用 濾 紙 從 銅 網(wǎng) 邊緣 吸 干 多 余 的 負(fù)染 液 , 染 色 30s , 之 后將 銅 網(wǎng) 自然 晾干 , 置 于 透 射 電 鏡 下·95 ·觀察 鐵脂 質(zhì) 體的 微 觀 形 貌 取 01mL 鐵脂 質(zhì) 體 , 用二 次 蒸 餾 水 稀 釋 10倍 , 使 用 激 光 粒 度儀 分 別 測(cè)定 鐵脂

19、 質(zhì) 體的 粒徑 分 布 125鐵脂 質(zhì) 體的體外 釋 放取 FAClip1, HEMElip 和 FAClip2各 2mL , 分 別 與 相 同 體 積 的 胃 液 或 腸 液 混 合 (胃 液 pH =13, 含有胃 蛋白酶 的 PBS 緩 沖 溶 液 ; 腸 液 pH =75, 含有 胰 脂 肪 酶 的 PBS 緩 沖 溶 液 , 將 混 合 液 注 入 透 析 袋 (MWCO 3500 , 并 放入裝 有 100mL 釋 放 介 質(zhì) 的 燒 杯 中 , 杯 口 用 錫 箔 紙 密 封 ,置 于 恒 溫 培 養(yǎng) 振 蕩 器 內(nèi) , 在 37 , 60r /min轉(zhuǎn) 速 下 測(cè)定 鐵脂

20、質(zhì) 體的體外 釋 放 在 一定的 時(shí) 間間 隔 取 透 析 液 1mL , 同 時(shí) 補(bǔ) 充相 同 體 積 的 新 鮮 釋 放 介 質(zhì) 以 釋 放 介 質(zhì) 為 空 白 對(duì) 照 , 使 用 紫 外 可見(jiàn) 分光光 度 計(jì) 測(cè)定 透 析 液 中 檸檬 酸 鐵或 血 紅素 鐵 的含 量 , 按 公式(2 計(jì) 算 累 積 釋 放 量 累 積 釋 放 量 =一定 時(shí) 間 釋 放 出 的 藥 物 總 量 /脂 質(zhì) 體 包封 的 藥 物 總 量 100%(2 2結(jié)果與討論 21鐵脂質(zhì)體的制備條件優(yōu)化本 實(shí)驗(yàn) 通過(guò)單 因 素 實(shí)驗(yàn) 考 察 了 卵磷脂 /膽 固 醇 、 藥 物 /卵磷脂 的 質(zhì) 量 比 及 超 聲

21、 時(shí) 間 對(duì) 包封率 的 影響 (見(jiàn) 圖 1a , b , c 膽 固 醇 是 許 多 天 然生物 膜 的 組 成成 分 , 可 以 改 變 膜 的 流 動(dòng) 性 和 通 透 性 在 制 備脂 質(zhì) 體 時(shí) , 卵磷脂 和 膽 固 醇 混 合 可 以 提 高 膜 的 完 整 性 , 同 時(shí) 提 高 脂 質(zhì) 體的 包封率 和 穩(wěn)定性 15從 圖 1可 以 發(fā) 現(xiàn) , 當(dāng) 大 豆卵磷脂與 膽 固 醇的 質(zhì) 量 比 為 10 1時(shí) ,FAClip1和 HEMElip 的 包封率最 高 (圖 1中 a1, b1 ; 其 質(zhì) 量 比 為 8 1時(shí) (圖 1中 c1 , FAClip2的 包封率最 高 卵磷脂

22、 量 一定 時(shí) , 脂 質(zhì) 體 包封 藥 物 的 量是 有 限 的 , 當(dāng) 包封率 達(dá) 到 最 大時(shí) , 隨 著 藥 物 的 增 加包封率 會(huì) 逐漸 下 降 圖 1中 a2, b2, c2顯 示 , 當(dāng) 藥 物與 卵磷脂 的 質(zhì) 量 比 分 別 為 1 65,1 6, 1 10時(shí) , FAClip1, HEMElip 和 FAClip2分 別 具有 最 大 包封率 此外 , 超 聲 時(shí) 間 對(duì) 脂 質(zhì) 體的 包封率 也 起著 至關(guān) 重 要 的作 用 (圖 1中 a3, b3, c3 , 超 聲 時(shí) 間 短 , 脂 質(zhì) 體的 粒徑 大 ; 超 聲 時(shí) 間過(guò) 長(zhǎng) , 又 會(huì) 使 脂 質(zhì) 體 破 裂

23、 , 導(dǎo)致 包封率 下 降 當(dāng)超 聲 時(shí) 間分 別 為 20,15, 10min 時(shí) , FAClip1, HEMElip 和 FAClip2分 別 具有 最 大 包封率 ·06 · aHEMElip1; bHEMElip ; cFAClip2圖 1制備條件優(yōu)化及對(duì)包封率 的 影響22鐵脂質(zhì)體的表征圖 2是 鐵脂 質(zhì) 體的 透 射 電 鏡 照 片 可 以 看出 , 鐵脂 質(zhì) 體 粒徑 分 布 比 較 均 勻 , 呈 圓 球 形 , 并 且 具有連 續(xù)膜 的 結(jié)構(gòu) 采 用 激 光 粒 度 分 布 儀 測(cè) 試 鐵脂 質(zhì) 體的 粒徑 分 布 (見(jiàn)圖 3 從 圖 3可 以 看出 ,

24、 鐵脂 質(zhì) 體的 粒徑 都比 較 小 , FAClip1, HEMElip 和 FAClip2的 粒徑 分 別 為 150, 60, 58nm其 中 , 采 用 薄膜旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 法 和 乙 醇 注 入 法 所得 到 的 FAClip1(圖 3a 和 FAClip2(圖 3c 粒徑 明 顯 不同 , 這 與 文 獻(xiàn) 16的 報(bào)道 一 致 , 即 乙 醇 注 入 法制 備的 脂 質(zhì) 體 粒徑 均 偏 小 , 并 且 穩(wěn)定性 好 而 采 用 薄膜旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 法制 備 的 HEMElip 的 粒徑 也 很小 , 約 為 60nm , 這可 能 是 由于 水 溶 性 血 紅素 鐵 具有 平 面的

25、 卟啉 環(huán) 結(jié)構(gòu) , 上面的 COO 基 團(tuán) 與 磷脂 分子的 親 水 頭 部 有 更 強(qiáng)的作用 力 所 致 17Lu 等 18報(bào)道 , 載 藥 脂 質(zhì) 體的 大 小 對(duì) 體 內(nèi) 藥 效 有 顯 著 的 影響 , 小 粒徑 的 粒 子 (200nm 可 以 增加 血管 的 滲 透 性 , 并 且 能 夠提 高藥 物 的 利 用 率 在 本 實(shí)驗(yàn)中 制 備 的 鐵脂 質(zhì) 體 粒徑 均 200nm , 其 中 FAClip2和 HEMElip 的 粒徑 100nm , 因 此 , 本 實(shí)驗(yàn) 制 備 的 鐵脂 質(zhì) 體 適 合 于體 內(nèi) 遞送 藥 物 aFAClip1; bHEMElip ; cFAC

26、lip2圖 2鐵脂質(zhì) 體的 負(fù)染電鏡 圖aFAClip1; bHEMElip ; cFAClip2圖 3鐵脂質(zhì) 體的 粒徑 分 布·16 ·23鐵脂質(zhì)體的體外釋放鐵脂 質(zhì) 體 在 胃 液 和 腸 液 中 的 釋 放曲 線 如圖 4所示 , 可 以 看出 , 在 胃 、 腸 液 中 分 別 釋 放 不同 的 時(shí) 間 , 鐵脂 質(zhì)體的 累 積 釋 放 量 變 化 趨 勢(shì) 一 致 , 即 FAClip1FAClip2HEMElip其 中 , FAClip1和 FAClip2粒徑 不 同 , 釋 放 35h 時(shí) , FAClip1在 胃 、 腸 液 中 累 積 釋 放 量 分 別

27、為 9743%和 7226%, 均 大 于 FAClip2的 5026%和 6572%, 這 是 由于 粒徑 對(duì) 載 藥 脂 質(zhì) 體的 釋 放 有 影響 , 小 粒徑脂 質(zhì) 體 緩 釋 性 更 好 18而 對(duì) 于 與FAClip2粒徑 相當(dāng)?shù)?HEMELip , 在 35h 時(shí) , 其 在 胃 、 腸 液 的 累 積 釋 放 量 分 別 為 282%和 452%, 釋 放速 度更 緩慢 , 緩 釋 性 更 好 , 可 能 是 由于 血 紅素 鐵 的分子 量 (65196 較 檸檬 酸 鐵 分子 量 (24494 大 , 其 與 膜 層 之 間 的作 用 力 也 大 于 檸檬 酸 鐵 與 膜 層

28、 之 間的作 用 力 所 致17體外 釋 放 結(jié)果表明 , 實(shí)驗(yàn)中 制 備 的 鐵脂 質(zhì) 體 都 具有 緩 釋 性 , 同 時(shí) 結(jié) 合 前 期 的 實(shí)驗(yàn) 結(jié)果17可知 , 藥 物 的分子 量 、 結(jié)構(gòu) 、 與 膜 層 作 用 力 及 脂 質(zhì) 體的 粒徑 大 小 對(duì) 脂 質(zhì)體的 藥 物 釋 放都 有 影響 a胃 液 ; b腸 液 圖 4鐵脂質(zhì) 體的體外 釋放 曲線3結(jié)束語(yǔ)采 用 薄膜旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 法 和 乙 醇 注 入 法 , 成 功 制 備 了 檸檬 酸 鐵脂 質(zhì) 體 (FAClip 和 血 紅素 鐵脂 質(zhì) 體 (Hemelip , 采 用動(dòng) 態(tài) 光 散 射 (DLS 、 透 射 電 鏡 (TEM 對(duì) 鐵脂 質(zhì) 體 做 了 表征 , 并進(jìn)行 了 體外