中性粒細(xì)胞凋亡與體外循環(huán)全身炎性反應(yīng)相關(guān)性研究

1、中性粒細(xì)胞凋亡與體外循環(huán)全身炎性反應(yīng)相關(guān)性研究              作者：趙志勇，閻志軍，趙硯麗，李建立，馮光興，何榮海，高永謙，于新江  【摘要】  目的 探討中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)凋亡與體外循環(huán)(extracorporeal circulation,ECC)全身炎性反應(yīng)的相關(guān)性及意義。 方法 50例ECC心臟直視手術(shù)病人，于ECC前、ECC結(jié)束時(shí)、ECC結(jié)束后4h、術(shù)后第1d晨四

2、個(gè)時(shí)點(diǎn)采取靜脈血，以全血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定PMN數(shù)量，流式細(xì)胞儀測(cè)定PMN凋亡率和PMN表面粘附分子CD11b表達(dá)變化，ELISA法測(cè)定血漿彈性蛋白酶濃度，透射電鏡觀察PMN凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果 PMN凋亡率在ECC期間明顯降低，與ECC時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。PMN數(shù)量、CD11b表達(dá)、血漿彈性蛋白酶濃度在ECC期間明顯升高，與其凋亡率呈負(fù)相關(guān)，且血漿彈性蛋白酶濃度與ECC時(shí)間呈正相關(guān)。透射電鏡下可見典型的PMN凋亡細(xì)胞。 結(jié)論 ECC導(dǎo)致PMN的凋亡受抑?jǐn)?shù)量增加、生存周期延長、CD11b表達(dá)上調(diào)、脫顆粒釋放彈性蛋白酶增加，加劇炎性反應(yīng)擴(kuò)散和組織損傷，炎性反應(yīng)進(jìn)一步遷延。 【關(guān)鍵詞】  中

3、性粒細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；體外循環(huán)；炎性反應(yīng)；CD11b；彈性蛋白酶   Correlation between Polymorphonuclear Neutrophil Apoptosis and   Abstract: OBJECTIVE   To investigate the correlation and significance between polymorphonuclear neutrophil (PMN) apoptosis and systemic inflammatory response to extracorpo

4、real circulation (ECC).METHODS  Fifty patients undergoing open heart surgery with ECC were studied. Blood samples were drawn from the central venous line before starting ECC, at the end of the ECC, 4 hours after ECC and on the frist postoperative morning. The PMN counts were performed by blood

5、cell counter. PMN were isolated, and its apoptosis and the expression of CD11b were evaluated by flow cytometry. The plasma concentration of elastase was determined by enzyme-linked immunosorbentassays. The morphological change of PMN apoptosis was detected by transmission electron microscope.RESULT

6、S  The rates of PMN apoptosis were significantly reduced during ECC until the frist postoperative morning, and the rate at 4 hours after ECC negatively correlated with the duration of ECC. The PMN counts,the expression of PMN CD11b and the levels of plasma elastase were markly increased during

7、ECC, and at 4 hours after ECC inversely correlated with PMN apoptosis rate. Peak elastase levels correlated positively with the duration of ECC. PMN apoptosis was showed under electron microscope.CONCLUSION  ECC suppress PMN apoptosis,increase PMN count,and prolong the functional lifespan of PM

8、N. The inhibition of PMN apoptosis cause upregulation of PMN CD11b expression and elevation of plasma PMN elastase level,potentiate and prolong the systemic inflammation response induced by ECC.   Key words：  Polymorphonuclear neutrophil；Apoptosis；Extracorporeal circulation；Systemic i

9、nflammation response；CD11b；Elastase   內(nèi)直視手術(shù)中重要的輔助手段。ECC可觸發(fā)全身炎性反應(yīng)1 。中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophil, PMN）是炎性反應(yīng)的重要標(biāo)志，在炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起著至關(guān)重要的作用。ECC導(dǎo)致體內(nèi)環(huán)境發(fā)生巨大變化，將對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡及其機(jī)能產(chǎn)生如何影響，目前國內(nèi)尚未見報(bào)道。因此，我們選擇了在我科行ECC心內(nèi)直視手術(shù)的50例病人，觀察其在ECC前后PMN凋亡率、數(shù)量、CD11b、血漿彈性蛋白酶水平的變化及其與PMN凋亡之間的關(guān)系，從而探究PMN凋亡和ECC全身炎性反應(yīng)之間的

10、相關(guān)性。   1  資料與方法    1.1  病例選擇  本組中男34例，女16例。年齡1.4260（20.5±20.75）歲。體重1071（34.3±20.24）kg。其中行主動(dòng)脈瓣和二尖瓣雙瓣置換術(shù)11例，室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)11例，房間隔缺損修補(bǔ)術(shù)9例，冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)6例，法洛四聯(lián)癥根治術(shù)5例，二尖瓣置換術(shù)4例，主動(dòng)脈瓣置換術(shù)4例。無系統(tǒng)性疾病，近1月內(nèi)未應(yīng)用過抗生素及對(duì)白細(xì)胞有細(xì)胞毒性的藥物（如非甾體類藥物）或免疫抑制劑。   1.2  麻醉及ECC方法&

11、#160; 全部病例均于術(shù)前30min肌注度冷丁1 mg/kg，東莨菪堿0.01 mg/kg，麻醉誘導(dǎo)為芬太尼5 g/kg，咪唑安定0.15 mg/kg，萬可松1.5 mg/kg，氣管插管全身麻醉，麻醉維持應(yīng)用芬太尼2530 g/kg，間斷應(yīng)用萬可松、異丙酚或恩氟烷吸入麻醉。ECC均采用Sarns-7400人工心肺機(jī)，西京-90鼓泡式氧合器和科威-87微栓濾器。血定安、林格氏液等預(yù)充，晶膠比10.60.8。轉(zhuǎn)機(jī)前常規(guī)肝素化抗凝（3 mg/kg），ECC中追加肝素抗凝，保持ACT480s。動(dòng)脈流量80120ml/（kg·min），術(shù)中維持血壓4060 mmHg（1 mmHg=0.133

12、 kPa）。血液中度稀釋，淺中度降溫。St.Thomas液間斷灌注心臟。停機(jī)后按11用量以魚精蛋白中和體內(nèi)肝素。術(shù)中不用激素、抑肽酶及全血，以免影響結(jié)果。ECC時(shí)間為39.78200.07（90.79±51.27）min。   1.3  標(biāo)本采集與處理  分別于ECC前（T1），ECC結(jié)束時(shí)（T2），ECC結(jié)束后4h（T3），術(shù)后第1d晨（T4）共4個(gè)時(shí)點(diǎn)取外周靜脈血標(biāo)本4 ml，加肝素抗凝（血:肝素=91），肝素化血不抗凝，1 h內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本處理。   用20PR-52D型低溫高速離心機(jī)（日本HITACHI公司）于4，200

13、0轉(zhuǎn)/min離心10 min，取血漿置于-80保存待測(cè)。取白細(xì)胞層和部分血漿與等量PBS液混合，置于2ml淋巴細(xì)胞分離液（北京華美公司）面上。4，2000轉(zhuǎn)/ min離心20 min，棄上清及淋巴細(xì)胞層，沉淀物即為PMN。若混有較多的紅細(xì)胞可用低滲蒸餾水去除紅細(xì)胞。   PBS液（0.01M，pH 7.4）將PMN制成1×106/ml細(xì)胞懸液待測(cè)，經(jīng)涂片瑞氏染色分類，PMN純度98% ，涂片臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞95% 。   1.4  指標(biāo)檢測(cè)    PMN校正值=PMN測(cè)得值×（ECC前Hct值H

14、ct測(cè)得值）     1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s )表示，采用自身對(duì)照，自身配對(duì)t檢驗(yàn)或t 檢驗(yàn)和相關(guān)分析，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。            2  結(jié)  果   2.1  PMN凋亡率  PMN凋亡率于ECC結(jié)束時(shí)、ECC結(jié)束后4 h均較ECC前明顯降低（P0.05、

15、P0.01），于術(shù)后第1 d晨恢復(fù)ECC前水平。凋亡率與ECC時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.4521，P0.05），見表1、圖1。   2.2  PMN數(shù)量  PMN數(shù)量在ECC期間明顯升高，并持續(xù)升高至術(shù)后第1 d晨（與ECC前相比P0.01）。ECC結(jié)束后4 h 其數(shù)量與其凋亡率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.4528，P0.05），見表1。   2.3  PMN CD11b表達(dá)  PMN CD11b表達(dá)在ECC結(jié)束時(shí)、ECC結(jié)束后4 h均較ECC前明顯增高（P0.05、P0.01），于術(shù)后第1 d晨恢復(fù)ECC前水平。CD11b

16、峰值水平與凋亡率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.6415，P0.01），見表1。   2.4  血漿彈性蛋白酶水平  血漿彈性蛋白酶水平在ECC結(jié)束時(shí)、ECC結(jié)束后4 h均顯著升高(與ECC前相比P0.01)，于術(shù)后第1d晨恢復(fù)ECC前水平。血漿彈性蛋白酶峰值水平與凋亡率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.4625，P0.01），并與ECC時(shí)間呈正相關(guān)（r=0.5757，P0.01），見表1。   2.5  PMN凋亡形態(tài)學(xué)變化  透射電鏡下觀察結(jié)果顯示有典型的凋亡PMN出現(xiàn)，細(xì)胞和細(xì)胞核體積縮小，染色質(zhì)固縮，聚集于核膜呈境界分明的新月形小體

17、，細(xì)胞漿濃縮，胞漿中各種細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本正常，見圖2。   圖2  PMN凋亡形態(tài)學(xué)變化（5.0K×ZOOM）   3  討  論   通常PMN在循環(huán)中存活不超過1天，通過凋亡表達(dá)而死亡。凋亡的PMN在膜完整的狀態(tài)下被巨噬細(xì)胞吞噬、清除，一方面使其不釋放內(nèi)容物，另一方面也縮短了其介導(dǎo)炎性反應(yīng)的時(shí)間。因此，PMN凋亡被認(rèn)為是炎癥消散的關(guān)鍵，是機(jī)體自我限制炎性反應(yīng)的一種重要方式2-3，但PMN凋亡非常容易被環(huán)境信號(hào)所調(diào)節(jié)改變。   實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PMN凋亡于ECC開始后明顯降低，至

18、術(shù)后第1天晨恢復(fù)術(shù)前水平。而其數(shù)量從ECC前到ECC結(jié)束后4h的變化趨勢(shì)與凋亡率的變化趨勢(shì)正好相反，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且PMN凋亡率與ECC持續(xù)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，這與Chello和Sakai的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同4-5。說明ECC使PMN生存的循環(huán)環(huán)境發(fā)生巨大變化，導(dǎo)致其凋亡受到抑制，受抑嚴(yán)重程度與ECC持續(xù)時(shí)間呈正比。凋亡受抑使PMN不能按正常程序死亡和被及時(shí)清除，其生命功能周期延  表1  不同時(shí)點(diǎn)PMN數(shù)量、凋亡率、CD11b 、彈性蛋白酶的變化注：*與ECC前比較，P0.05；*與ECC前比較，P0.01 長，數(shù)量增加，釋放大量具有組織毒性及酶解基質(zhì)蛋白作用的內(nèi)容物。同時(shí)產(chǎn)生如前列

19、腺素、白三烯、血小板活化因子和活性氧等多種炎性介質(zhì)，使炎性反應(yīng)遷延并放大，組織損傷加重6。隨著ECC的結(jié)束，凋亡抑制因素解除，PMN凋亡率逐漸恢復(fù)ECC前水平。   術(shù)后第1天晨PMN凋亡率基本恢復(fù)ECC前水平，而其數(shù)目卻持續(xù)增多達(dá)到高峰，可能是由于機(jī)體對(duì)全身炎性反應(yīng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，使著邊PMN動(dòng)員以及骨髓釋放大量未成熟PMN入血所致7。   炎性反應(yīng)中PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是其游出血管壁，釋放有害物質(zhì)引起組織損傷的關(guān)鍵步驟8。PMN的粘附是由其膜表面的粘附分子所介導(dǎo)的，其中以CD11b/CD18最為重要。本實(shí)驗(yàn)中顯示CD11b表達(dá)峰值與PMN凋亡率呈

20、負(fù)相關(guān)，表明ECC中由于PMN凋亡受抑制，使作為PMN活化標(biāo)志物的CD11b表達(dá)亢進(jìn)，促進(jìn)PMN與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，游出血管壁，釋放有害物質(zhì)引起組織損傷。同時(shí)CD11b表達(dá)上調(diào)又可進(jìn)一步抑制PMN凋亡9，導(dǎo)致ECC全身炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和擴(kuò)大。當(dāng)ECC結(jié)束，PMN凋亡逐漸恢復(fù)，CD11b表達(dá)也恢復(fù)到正常水平。   與Tang等10實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，血漿彈性蛋白酶水平于ECC中開始明顯升高，至術(shù)后第1天晨恢復(fù)術(shù)前水平。其峰值水平與PMN凋亡率呈負(fù)相關(guān)，與ECC時(shí)間呈正相關(guān)，這說明ECC導(dǎo)致PMN凋亡受抑制，功能周期延長，PMN不能及時(shí)發(fā)生凋亡，使其趨化和脫顆粒功能升高，導(dǎo)致彈性蛋白

21、酶等繼發(fā)性炎性介質(zhì)大量向細(xì)胞間質(zhì)逸出，引起細(xì)胞外基質(zhì)中各種成分降解，激活前明膠酶原破壞血管內(nèi)皮基膜，破壞內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞間緊密連接，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞向組織浸潤，造成組織損傷11。隨著ECC后PMN凋亡的恢復(fù)，其游動(dòng)擴(kuò)散，脫顆粒和趨化功能降低，血漿彈性蛋白酶水平亦恢復(fù)正常。   正常生理情況下，PMN的增殖與凋亡保持動(dòng)態(tài)平衡，這既有利于機(jī)體的防御反應(yīng)又有利于炎性反應(yīng)的消散。當(dāng)ECC時(shí)，由于多種因素的綜合作用使PMN凋亡受到抑制，細(xì)胞活化，進(jìn)而使CD11b表達(dá)上調(diào)和內(nèi)皮細(xì)胞粘附增強(qiáng)，釋放彈性蛋白酶等炎性介質(zhì)增多，加劇炎性反應(yīng)擴(kuò)散和組織損害，導(dǎo)致ECC全身炎性反應(yīng)進(jìn)一步遷延。隨著E

22、CC結(jié)束，PMN凋亡恢復(fù)正常，炎性反應(yīng)得以控制。   由于凋亡是PMN介導(dǎo)炎性反應(yīng)終止的重要生物步驟。因此，對(duì)ECC中PMN凋亡機(jī)制及其機(jī)能的變化情況作進(jìn)一步深入研究，將為我們監(jiān)控和調(diào)節(jié)體外循環(huán)全身炎性反應(yīng)，預(yù)防和治療應(yīng)激性損傷開辟一條嶄新的途徑。【參考文獻(xiàn)】  1 Elgebaly SA, Houser SL, el Kerm AF,et al. Evidence of cardiac inflammation after open heart operations J. Ann Thorac Surg, 1994, 57(2): 391-396.2 Simon

23、 HU. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammationJ. Immunol Rev, 2003, 193: 101-110.3 Van Dyke TE, Serhan CN. Resolution of inflammation: a new paradigm for the pathogenesis of periodontal diseaseJ. J Dent Res, 2003, 82 (2):82-90.4 Chello M, Mastroroberto P, Quirino A,et al. Inhibition of neutrophil apoptosis after coronary bypass operation with cardiopulmonary bypassJ. Ann Thorac Surg, 2002, 73(1