女貞子藥材HPLC指紋圖譜的初步研究

1、女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí),全國產(chǎn)區(qū)較多1。女貞子含女貞子苷、洋橄欖苦苷、齊墩果酸、乙酰齊墩果酸、熊果酸、乙酰熊果酸、4-羥基-苯乙基-D-葡萄糖苷、樺木醇、甘露醇、棕櫚酸、脂肪酸、蘋果酸等成分,其中三萜類成分齊墩果酸與熊果酸、皂苷類成分女貞子苷等在紫外區(qū)吸收均較弱,采用紫外檢測器分析效果不太理想2,3,7。本文采用ELSD(蒸發(fā)光散射留時(shí)間短,但分離不佳;而甲醇-水(4159則保留時(shí)間適中,可使樣品中的5-O-甲基維斯阿米醇苷有較好的分離。以水稀釋的樣品雜質(zhì)很多,無法進(jìn)樣,故本標(biāo)準(zhǔn)選用甲醇為稀釋溶媒。用甲醇適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)樣,測定其5-O

2、-甲基維斯阿米醇苷的含量,方法快速,重現(xiàn)性良好,可作為考察舒風(fēng)口服液及防風(fēng)藥材質(zhì)量的檢測手段。中華人民共和國藥典2000年版和其他文獻(xiàn)中同時(shí)測定升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量1-2,選用檢測波長254nm,但對不少制劑同時(shí)測定發(fā)現(xiàn),由于成分限制,分離不佳,故只能測定5-O-甲基維斯阿米醇苷,經(jīng)光譜實(shí)驗(yàn)選定測定波長為293nm。參考文獻(xiàn):1國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2000年版一部S.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000.125.2田菁,李發(fā)美.HPLC法測定感冒清熱顆粒中升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量J.中成藥,2002,24(9:671.(編輯:鄒元平女貞子藥材HPLC指紋圖

3、譜的初步研究徐長根1,李濤2,傅強(qiáng)1(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,西安710049;2.陜西省藥品檢驗(yàn)所,西安710061摘要:目的建立女貞子中藥材的HPLC指紋圖譜分析方法。方法采用HPLC-ELSD法,色譜柱:Lichrospher C18柱(4.6mm×250mm,5m;Alltech ELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測器;流動相:甲醇-水(梯度洗脫。以齊墩果酸為參照物分析了16批不同產(chǎn)地的女貞子樣品,采用計(jì)算機(jī)輔助相似性評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果女貞子中藥材HPLC指紋圖譜由14個(gè)特征峰構(gòu)成指紋圖譜的特征,10批樣品的指紋圖譜的相似度均大于0.90,符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求,所

4、建立的指紋圖譜具有穩(wěn)定、重現(xiàn)的特點(diǎn)。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、簡單,其色譜指紋圖譜可用于女貞子中藥材的鑒別和質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞:女貞子;指紋圖譜;HPLC-ELSD中圖分類號:R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1003-9783(200505-0368-04Preliminary Study on Fingerprints of Fructus Ligustri Lucidi by HPLCXU Changgen1,LI Tao2,FU Qiang1(1.Department of Pharmacy,Medical College,Xian Jiaotong University,Xian 710049

5、;2.Shaanxi Institute for Drug Control,Xian710061Abstract:Objective To establish the HPLC fingerprints of Fructus Ligustri Lucidi.Methods HPLC-ELSD analysis was carried out with Lichrospher C18column(4.6mm×250mm,5m.The detector was Alltech ELSD2000.The method was developed by gradient elution wi

6、th methanol and water as the mobile phase.With oleanolic acid as the marker,sixteen batches of Fructus Ligustri Lucidi were analyzed with computer-aided similarity evaluation system.Results HPLC finger-prints of Fructus Ligustri Lucidi showed14characteristic peaks and the similarity of the fingerpri

7、nts of10batches of samples was over0.90,indicating the fingerprints being stable and repeatable.Conclusion The method is simple,accurate and with a good reproducibility,and can be used for the identification and quality control of Fructus Ligustri Lucidi.Keywords:Fructus Ligustri Lucidi;Fingerprints

8、;HPLC-ELSD收稿日期:2005-05-16作者簡介:徐長根(1968-,女,藥物分析專業(yè)在職研究生,主要從事藥品檢驗(yàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。Tel:(02985257416。檢測器,用反相高效液相色譜法對女貞子指紋圖譜進(jìn)行研究,并進(jìn)行了方法學(xué)考察,獲得了滿意的結(jié)果。1儀器與試藥1.1儀器Waters Alliance HT型高效液相色譜儀, Alltech ELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測器,SPB-3全自動空氣源(北京中惠普分析技術(shù)研究所。1.2試藥甲醇(色譜純,Tedia公司,美國,水為超純水,其他試劑均為分析純。齊墩果酸與熊果酸對照品(均由中國藥品生物制品檢定所提供,批號分別為110

9、709-200304、110742-200313,16批試驗(yàn)用女貞子經(jīng)陜西省藥品檢驗(yàn)所中藥室郝武常主任鑒定均為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí),來源見表1。表1女貞子藥材來源2方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱:Lichrospher C18柱(4.6 mm×250mm,5m(江蘇漢邦公司;流動相:甲醇-水線性梯度洗脫(見表2;柱溫:30;ELSD 漂移管溫度:95;霧化氣源選用純凈空氣源:2.5 L/min;放大系數(shù)(Gain:4;撞擊器(Impactor: off。在此色譜條件下,理論板數(shù)以齊墩果酸峰計(jì)不低于5000。表2梯度洗脫時(shí)間表2.2供

10、試品溶液的制備取本品粉碎,精密稱取1.0g,置50mL具塞錐形瓶中,精密加甲醇25mL,稱重,超聲處理45min,取出,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,濾液再用0.45m 微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.3對照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸與熊果酸對照品適量,加甲醇制成每1mL分別含0.4mg 與0.1mg的混合溶液,搖勻,即得。2.4測定方法精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10L,注入液相色譜儀,測定。記錄女貞子色譜圖2h,由圖可見60min后已無色譜峰出現(xiàn),因此將60min以前的色譜圖作為女貞子指紋圖譜。以供試品溶液中齊墩果酸為參照峰(S分別計(jì)算各峰的相對保留時(shí)

11、間和相對峰面積的比值,采用國家藥典委員會相似度對比軟件2004A版進(jìn)行相似度計(jì)算4,5,6。2.5精密度試驗(yàn)取11號樣品細(xì)粉,按供試品溶液制備方法制得供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄指紋圖譜。結(jié)果表明,各共有色譜峰的相對保留時(shí)間的RSD(%在0.422.55之間,相對峰面積的RSD (%為0.312.34,符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求;以第3張圖作為參照譜圖,采用中位數(shù)法產(chǎn)生對照指紋圖譜,計(jì)算相似度,結(jié)果各指紋圖譜的相似度均大于0.90,符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取11號樣品細(xì)粉,按供試品溶液制備方法制得供試品溶液,分別在0,6,12,18, 24h進(jìn)樣,記錄指紋圖譜。結(jié)果各共有

12、色譜峰的相對保留時(shí)間的RSD(%在0.251.87之間,相對峰面積的RSD(%為0.302.17,符合指紋圖譜要求;以第3張圖作為參照譜圖,采用中位數(shù)法產(chǎn)生對照指紋圖譜,計(jì)算相似度,結(jié)果各指紋圖譜的相似度均大于0.90,符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.7重復(fù)性試驗(yàn)取11號樣品細(xì)粉5份,按供試品溶液制備方法制得供試品溶液,分別進(jìn)樣,記錄指紋圖譜。結(jié)果表明,各共有色譜峰的相對保留時(shí)間的RSD(%在0.271.95之間,相對峰面積的RSD(%為0.231.99,符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求;以第3份樣品圖作為參照譜圖,采用中位數(shù)法產(chǎn)生對照指紋圖譜,計(jì)算相似度,結(jié)果各

13、指紋圖譜的相似度均大于0.90,符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。2.8樣品測定取16批女貞子進(jìn)行測定,共獲得14個(gè)共有色譜峰(其中10號峰為S峰。典型色譜圖(No.15見圖1。各共有色譜峰相對保留時(shí)間見表2,基本符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求,但各共有峰的相對峰面積RSD值卻較大(見表3,主要反映了各地產(chǎn)區(qū)的女貞子藥材中各共有成分的含量比例差異較大。配合生藥學(xué)鑒定結(jié)果,并參考中國藥品生物制品檢定所的標(biāo)準(zhǔn)藥材,從以上16批藥No. 1 2 3 4 5 6 7 8產(chǎn)地浙江陜西渭南四川安徽合肥江蘇陜西寶雞廣西南寧江蘇No.910111213141516產(chǎn)地福建安徽浙江杭州湖南河南中檢所(批號:121041-

14、200302廣西河南時(shí)間/min10152055流速/mLmin-11.01.01.01.01.0甲醇/%20407085100水/%80603015材中選取10批各組分含量相對較高質(zhì)量較優(yōu)的藥材(No.1,3,4,5,7,8,9,11,14,156,色譜圖見圖2,采用國家藥典委員會的相似度比較軟件(2004A版,以No.14號樣品圖作為參照譜圖,采用中位數(shù)法產(chǎn)生對照指紋圖譜,計(jì)算相似度,結(jié)果各指紋圖譜的相似度均大于0.90,符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求(見表4。峰號樣1樣2樣3樣4樣5樣6樣7樣8樣9樣10樣11樣12樣13樣14樣15樣16 RSD/%10.0590.0590.0600.06

15、10.0590.0580.0580.0590.0600.0610.0580.0590.0600.0610.0600.0581.9020.3010.3000.3020.3000.3010.3020.3030.3020.3000.2990.2980.2990.3000.3010.3020.3020.4630.3650.3650.3660.3670.3680.3660.3650.3640.3640.3650.3640.3660.3670.3670.3660.3680.3640.3770.3760.3750.3780.3770.3760.3780.3760.3750.3750.3770.3770.37

16、80.3780.3750.3761.2050.3880.3890.3880.3890.3910.3910.3920.3920.3910.3880.3890.3900.3900.3900.3890.3880.3660.4170.4180.4190.4160.4170.4170.4180.4190.4200.4200.4190.4200.4190.4190.4180.4160.3270.4350.4350.4330.4340.4350.4330.4340.4370.4370.4380.4360.4370.4360.4360.4380.4340.3780.6700.6690.6710.6740.67

17、10.6700.6730.6690.6700.6720.6740.6690.6700.6730.6710.6720.2590.7960.7980.7970.7990.7960.7980.7970.7990.7970.7990.7960.7980.7960.7980.7970.7990.14101111111111111111111.0171.0191.0201.0191.0211.0181.0211.0191.0171.0211.0211.0181.0201.0191.0211.0190.14121.1321.1301.1331.1341.1321.1301.1311.1331.1311.13

18、01.1321.1341.1301.1331.1341.1300.14131.2561.2581.2551.2571.2561.2591.2551.2581.2561.2571.2581.2551.2571.2561.2591.2550.11141.4511.4531.4491.4501.4521.4511.4531.4491.4511.4531.4491.4521.4531.4501.4521.4490.11表216批樣品主要共有峰相對保留時(shí)間表316批樣品主要共有峰相對峰面積峰號樣1樣2樣3樣4樣5樣6樣7樣8樣9樣10樣11樣12樣13樣14樣15樣1616.8194.8696.8286

19、.8316.8386.4236.8496.8466.8266.2566.8356.9896.2536.8316.8356.52320.0270.0050.0210.0290.0270.0150.0220.0300.0280.0250.0250.0230.0180.0290.0320.02130.0850.0290.0790.0830.0900.0730.1050.0940.0910.0650.0860.0590.0680.0990.1000.07940.0690.0620.0780.0760.0790.0860.0730.0850.0750.0920.0790.0780.0560.0830.0

20、850.07255.7264.8325.7425.7605.7525.6525.7415.7725.7535.6635.7465.8964.2535.7635.7525.74360.2960.3000.2860.2830.2980.3120.3000.2960.2890.3000.2860.2440.2560.2920.2970.28276.4236.2536.5006.4866.5096.6006.5196.5236.4926.2566.5055.7895.6326.5126.5206.49380.0790.0620.0850.0770.0760.0650.0860.0860.0790.09

21、50.0900.0580.0790.0820.0790.02590.0590.0460.0600.0550.0530.0480.0450.0490.0450.0650.0510.0590.0420.0470.0440.037101111111111111111110.2010.1820.1950.2050.2010.1590.2090.2060.2100.1460.2070.2650.1650.2030.2000.234120.0400.0320.0490.0600.0590.0780.0510.0580.0610.0470.0590.0500.0450.0550.0500.042130.03

22、50.0270.0380.0410.0410.0350.0430.0430.0360.0230.0420.0250.0290.0390.0360.029140.0090.0150.0200.0250.0240.0200.0280.0280.0280.0230.0310.0190.0120.0230.0270.028t/min圖1女貞子藥材指紋圖譜t/min圖210批女貞子藥材指紋圖譜3討論3.1提取溶劑與提取方法的選擇采用乙醇、乙醚、無水乙醇、甲醇、50%甲醇、氯仿、丙酮等多種溶劑進(jìn)行索氏提取,以甲醇提取液出峰數(shù)較多且活性成分齊墩果酸得率略高,故選擇甲醇作提取溶劑。用甲醇作溶劑,對比索氏提取與

23、超聲處理兩種提取方法,結(jié)果二法所得峰數(shù)與各峰面積未見明顯差異,為便于操作,選擇超聲處理作為供試品處理方法。3.2色譜柱的選擇試驗(yàn)中,選用了不同類型的色譜柱:(1GL Sciences Inc.公司Inertsil ODS-3(4.6×250mm ,5m;(2江蘇漢邦科技LichrospherC 18(4.6×250mm ,5m;(3SHMADZU 公司VP-ODS (4.6×250mm ;(4Phenomenex 公司Luna C 18(4.6×250mm ,5m;(5Waters 公司SymmetryShield RP 18(3.9×150m

24、m ,5m。以上色譜柱,江蘇漢邦科技Lichrospher C 18對女貞子中齊墩果酸(主要活性成分與熊果酸的分離效果最好,加之價(jià)格較低,通用性強(qiáng),故選用。3.3流動相的選擇試驗(yàn)過程中對比了不同的流動相:甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水、乙腈-0.5%醋酸銨溶液、甲醇-0.5%醋酸銨溶液等多種流動相體系,其中以甲醇-水進(jìn)行線性梯度洗脫即能使各成分得到較好的分離,故選用2,7。3.4檢測方法的選擇蒸發(fā)光散射檢測器是一種通用型質(zhì)量檢測器,響應(yīng)不依賴于樣品的光學(xué)特性,能分析任何揮發(fā)性低于流動相的化合物,并且能在多溶劑梯度的情況下獲得穩(wěn)定的基線,使得分辨率更好、分離速度更快,所以,對含較多紫外末端吸

25、收和紫外吸收較弱成分的女貞子藥材進(jìn)行HPLC 指紋分析,并采用蒸發(fā)光散射檢測器行進(jìn)檢測。參考文獻(xiàn):1國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2000年版一部S .北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000.249.2呂曙光.中藥女貞子中齊墩果酸、熊果酸的高效液相色譜分析J .藥物分析雜志,1993,13(5:291.3劉美蘭.不同產(chǎn)地的女貞子中齊墩果酸的含量比較J .中草藥,1990,21(6:20.4屠鵬飛.高效液相法制定中藥材和中藥注射劑特征指紋圖譜的探討J .中成藥,2000,22(7:516.5張克榮,畢開順.白芍HPLC 指紋圖譜相似度的分析J .中國中藥雜志,2004,29(4:380.6李曉蒙,何新榮.秦艽藥材HPLC 指紋圖譜研究J .中成藥,2004,26(1:4.7李濤,郝武常