大鼠心肌缺血再灌注損傷及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與一氧化氮心肌保護(hù)作用的研究

1、    大鼠心肌缺血再灌注損傷及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)與一氧化氮心肌保護(hù)作用的研究作者：吳丹寧，賈國(guó)良，馬穎艷，李偉 作者單位：第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 心內(nèi)科， 陜西 西安 710032【摘要】 目的 中性粒細(xì)胞(Neu)心肌浸潤(rùn)是心肌缺血-再灌注(I/R)損傷的重要機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在SD大鼠中建立心肌I/R模型，研究I/R過(guò)程中心肌損傷與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，并通過(guò)左型精氨酸(L-Arg)干預(yù)，探討一氧化氮(NO)對(duì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的影響及其在心肌I/R損傷中的保護(hù)作用。方法 實(shí)驗(yàn)分對(duì)照(CON)組、LArg處理組。每組又分缺血前、缺血40 min、再灌1 h

2、、再灌3h和再灌6 h 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別測(cè)定各組各時(shí)間點(diǎn)血清肌酸磷酸激酶(CPK)及心肌勻漿丙二醛(MDA)值，并觀察心肌組織病理學(xué)的改變。結(jié)果 (1)CPK及心肌勻漿MDA測(cè)定結(jié)果：再灌注后各時(shí)相血清CPK及肌勻漿MDA含量較缺血前明顯上升，再灌注3h后達(dá)到高峰。LArg組中再灌注后各時(shí)相點(diǎn)血清CPK及肌勻漿MDA明顯低于CON組(P<0.05)。(2)HE染色結(jié)果：缺血前心肌細(xì)胞完整，邊界清楚，心肌橫紋清晰。CON組：再灌后1h出現(xiàn)Neu心肌浸潤(rùn)，再灌3 h Neu心肌浸潤(rùn)更明顯， 累及心肌全層，伴有局灶心肌壞死;再灌6 h后Neu浸潤(rùn)尤甚，大片心肌壞死，并可見(jiàn)小血管內(nèi)Neu聚集現(xiàn)象

3、。LArg組：再灌注后Neu心肌浸潤(rùn)明顯減少，再灌6 h心肌壞死灶較CON組明顯縮小。結(jié)論 (1)心肌I/R過(guò)程中有大量Neu心肌浸潤(rùn)，與心肌損傷密切。(2)LArg能抑制Neu心肌浸潤(rùn)，具有心肌保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】 中性粒細(xì)胞; 缺血再灌注; 一氧化氮; 精氨酸; 心肌保護(hù)The Experimental Study on the Role of Neutrophil Infiltration and the Myocardial Protection of the Nitric Oxide During Ischemia Reperfusion in RatsWu Danning，Jia

4、Guoliang，Ma Yinyan，Li Wei(Department of Cardiology，the 117th Hospital.of PLA,Hangzhou 310013,China)Abstract： Objective The neutrophil infiltration is one of the reasons which lead to the myocardial ischemic reperfusion (I/R) injury. The study aimed at investigating the changes between myocardic inju

5、ry and neutrophil infiltration during I/R, and inquiring into the mechanisms of myocardial protection against I/R injury by intravenous infusion of Larginine(LArg) in ratty myocardial I/R model. Methods The rats were divided into 2 groups, including the Control and LArg infusion group, each with pre

6、-ischemia , postischemia 40mins, reperfusion for 1h ,3 hrs and 6hrs subunits. The changes of serum CPK、myocardial MDA、 histopathology were examined .Results Result were showed that the levels of serum CPK and myocardial MDA increased after reperfusion, and reached the highest at 3hrs followed reperf

7、usion, the content in the LArg groups were significantly lower(P<0.05 Vs CON) and that histopathologically the myocardial neutrophil infiltration appeared at 1h followed reperfusion, and increased with the continue of the reperfusion , accompanied by the myocyte necrosis in the control group. Wit

8、h the LArg infusion intraveneously following ischemia, decrease of neutrophil infiltration and myocyte necrosis were showed in rats .Conclusion (1)The myocardial neutrophil infiltration indicates neutrophials participate in impairing the myocardium during I/R; (2)The LArg prevents the neutrophils fr

9、om myocardial infiltration ,and ameliorate the ischemic-reperfusion injury.Key words： neutrophill ; ischemia reperfusion; nitric oxide; Largnine; myocardium protection隨著靜脈溶栓及經(jīng)皮腔內(nèi)球囊成形術(shù)治療急性心肌梗死的開(kāi)展，缺血再灌注損傷的研究受到廣泛重視。心肌缺血再灌注損傷是一種復(fù)雜的病理生理變化，其包括再灌注心律失常、心肌暈厥、再灌注心肌死亡及無(wú)復(fù)流現(xiàn)象等，中性粒細(xì)胞(Neu)心肌浸潤(rùn)與此密切相關(guān)。一氧化氮(NO)具有舒張血管

10、、調(diào)節(jié)血壓、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等多種功能;病理狀態(tài)下，NO還與多種心血管疾病的病理?yè)p傷及修復(fù)有關(guān)。本研究旨在在SD大鼠中建立缺血-再灌注(I/R)模型，通過(guò)心肌病理學(xué)檢查、血清CPK及肌勻漿丙二醛(MDA)測(cè)定分析，以及左型精氨酸(L-Arg)干預(yù)作用，探討I/R過(guò)程中心肌損傷與Neu心肌浸潤(rùn)的關(guān)系，及NO對(duì)Neu心肌浸潤(rùn)的作用。1 材料與方法11 動(dòng)物模型的建立(1) 動(dòng)物： 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供。(2) 模型制備：以4%戍巴比妥鈉(40 mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉成功后，行氣管切開(kāi)術(shù)，接人工呼吸機(jī)(頻率60次/min

11、， 潮氣量30 ml)。分離頸淺靜脈及頸總動(dòng)脈，分別行動(dòng)、靜脈插管術(shù)。靜脈插管接微泵注射器，注射生理鹽水2 ml/h。動(dòng)脈插管接八導(dǎo)生理儀之載波放大器及血壓表，記錄大鼠動(dòng)脈壓(收縮壓SBP，舒張壓DBP及平均壓MBP)。心電圖導(dǎo)聯(lián)線與大鼠四肢相連接入心電圖放大器，記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖。于大鼠胸骨左緣24肋處，逐層打開(kāi)皮膚、肌肉及肋骨，暴露心臟，分離心包膜，用眼科小圓針在前降支起始后0.20.3 cm處穿一結(jié)扎線，再將結(jié)扎線兩頭穿過(guò)23 cm的塑料管備用。手術(shù)完成后穩(wěn)定10 min。(3)進(jìn)行缺血-再灌注模型的建立：將一小塑料管順結(jié)扎線滑行，收緊結(jié)扎線，以止血鉗夾緊塑料管固定，造成缺血。放松止血鉗

12、，取出小塑料管，形成再灌注。缺血時(shí)，心肌局部變暗，活動(dòng)減弱，動(dòng)脈平均血壓下降(>10 mmHg)，心電圖STT呈明顯上抬或單向曲線。再灌注時(shí)，心肌局部搏動(dòng)恢復(fù)，即刻動(dòng)脈平均壓恢復(fù)至缺血前，心電圖STT段回落1/2以上。12 實(shí)驗(yàn)方案動(dòng)物分組：50只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LArg干預(yù)組。每組隨機(jī)又分為缺血前、缺血40 min后、再灌注1 h、再灌注3 h及再灌注6 h 5個(gè)時(shí)相點(diǎn)。每組25只大鼠，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)5只。對(duì)照組：即模型組。建立缺血-再灌注模型，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用生理鹽水靜脈維持。于各不同時(shí)間點(diǎn)于右心房抽取靜脈血;用10%氯化鉀靜脈內(nèi)注射處死動(dòng)物，取出心臟后，分別留取缺血區(qū)及非缺血區(qū)心肌組織

13、。 LArg干預(yù)組：于缺血后即給予LArg(40 mg/kg)靜脈一次性注射，以后用生理鹽水維持(2 ml/h)。處死動(dòng)物及留取標(biāo)本同對(duì)照組。13 觀察指標(biāo)131 心肌酶測(cè)定抽取右房血2 ml，放置40 min后，以1 000 r/min離心510 min，留取血清，封口，置-80低溫冰箱凍存，集中送檢。用酶動(dòng)力學(xué)法，在日立7150全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定(試劑盒CPKNAC系澳大利亞TRACE公司產(chǎn)品)，單位IU/L。132 心肌MDA測(cè)定測(cè)定試劑盒由暨南大學(xué)病理生理教研室提供，并依照其提供的方法進(jìn)行測(cè)定。取缺血-再灌注區(qū)的心肌組織試紙吸除水分稱重后，置于研磨器內(nèi)，每克組織加生理鹽水4 ml，

14、研磨成心肌組織勻漿，然后以3 000 r/min的速度離心15 min，吸取上清液置管封存冷凍。測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，MDA的單位：nmol/g(每克濕質(zhì)量組織MDA的含量)。133 心肌冰凍切片的制備在保溫瓶中預(yù)先裝滿液氮，然后將盛有異戍烷(進(jìn)口分裝)的燒杯放入液氮中，用長(zhǎng)鑷不斷攪動(dòng)，直至異戍烷出現(xiàn)一層白膜(此時(shí)溫度達(dá)-155-160)，迅速將新鮮心肌組織標(biāo)本投入異戍烷，不停攪動(dòng)2030 s后，取出后用OCT包埋劑包埋，置-20恒溫冰凍箱切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為5m。切片后迅速用95%的乙醇固定1015 min，置-20的冰箱中保存?zhèn)溆谩?34 HE染色置心肌切片標(biāo)本于蘇木精染液中34

15、 min浸染，取出洗滌后置于伊紅染液中12 min，洗滌后依次于80%，90%，95%，100%的乙醇中脫水后35 min，二甲苯中透明3 min。用中性樹(shù)膠封片，備檢。14 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用第四軍醫(yī)大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室提供的SPLM統(tǒng)計(jì)軟件包。數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組均數(shù)間比較用t檢驗(yàn), 多組均數(shù)間用方差分析。P<0.05為相差顯著，P<0.01為相差非常顯著。2 結(jié)果2.1 心肌CPK變化再灌注后各時(shí)相點(diǎn)血清CPK較缺血前均有不同的增高, 再灌注3 h達(dá)高峰。L Arg組再灌注后各時(shí)相點(diǎn)血清CPK分別低于CON組(P<0.05)。(表1)表1

16、 大鼠心肌缺血再灌注血清中CPK改變(略)22 心肌勻漿MDA變化再灌注后各時(shí)相點(diǎn)心肌勻漿MDA的含量均有不同程度的上升, 再灌注3 h為高峰。LArg組再灌注后各時(shí)相點(diǎn)心肌勻漿MDA分別低于CON組(P<0.05) 。(表2)表2 大鼠心肌缺血-再灌注心肌勻漿中MDA變化(略)23 病理H-E染色病理檢查結(jié)果: 缺血前正常心肌組織中心肌纖維排列整齊， 細(xì)胞邊界完整，心肌橫紋清晰。再灌注后1 h,，心肌中出現(xiàn)Neu浸潤(rùn)，位于心內(nèi)膜下，心肌組織中未見(jiàn)明顯壞死灶。再灌注后3 h，Neu浸潤(rùn)明顯，心內(nèi)膜、心肌層及心外膜均可見(jiàn)，心肌橫紋消失，出現(xiàn)局灶性心肌壞死;再灌注6 h后，大量心肌細(xì)胞壞死伴

17、Neu浸潤(rùn)，以心外膜明顯，并可見(jiàn)小血管有大量Neu聚集。LArg干預(yù)組：大鼠心肌組織再灌注后1 h無(wú)明顯Neu心肌浸潤(rùn)，再灌注6 h僅少量Neu心肌浸潤(rùn)，心肌壞死灶也明顯減少。3 討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：I/R過(guò)程中，隨著Neu心肌浸潤(rùn)的加重，血清中CPK及心肌勻漿中MDA也明顯升高，心肌組織中形成的壞死灶也明顯增加。Larg干預(yù)后，Neu心肌浸潤(rùn)明顯減輕，血清中CPK及心肌勻漿中MDA也明顯降低(P<0.05)，病理心肌壞死也明顯減少。心肌I/R過(guò)程中有大量Neu心肌浸潤(rùn)，與心肌損傷密切;LArg能抑制Neu心肌浸潤(rùn)，具有心肌保護(hù)作用。國(guó)外也有類似報(bào)道1。 目前認(rèn)為I/R損傷與心肌內(nèi)氧自由

18、基大量產(chǎn)生、Neu浸潤(rùn)及心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載有關(guān)，其中Neu心肌浸潤(rùn)具有重要作用。Neu不僅能產(chǎn)生大量氧自由基，氧化胞膜及各種蛋白質(zhì);還能釋放各種炎性介質(zhì)及溶酶體酶等有害物質(zhì)直接損傷細(xì)胞。另外,微血管中有大量的Nue浸潤(rùn)可堵塞血管，產(chǎn)生再灌注的 “無(wú)復(fù)流”現(xiàn)象，加重了I/R損傷。 因此Neu心肌浸潤(rùn)在I/R損傷具有重要的病理意義，阻斷Neu的心肌浸潤(rùn)有助于減輕I/R損傷。LArg為一氧化氮合酶(NOS)的底物，血管內(nèi)皮細(xì)胞中 LArg和O2在NOS的催化下，由多種輔助因子傳遞電子，生成NO和瓜氨酸3。NO具有舒張血管、調(diào)節(jié)血壓;抑制血小板聚集、防止血栓;保護(hù)細(xì)胞及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的功能4,5。NO

19、還具有抑制氧自由基產(chǎn)生的作用6。缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)源性NO生成減少7。用LArg進(jìn)行干預(yù)后，增加了NO合成的底物，促進(jìn)了內(nèi)皮合成內(nèi)源性NO，同時(shí)抑制內(nèi)皮各種炎性因子的產(chǎn)生及氧自由基的合成，減少其對(duì)內(nèi)皮的損傷8;近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Neu浸潤(rùn)心肌與細(xì)胞間粘附分子ICAM1與CD11/CD18密切相關(guān) 9。LArg 干預(yù)后可能抑制了內(nèi)皮細(xì)胞及Neu 的粘附分子的表達(dá)，從而減少了Neu的心肌浸潤(rùn)10，發(fā)揮其心肌保護(hù)作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Sato H,Zhao Z Q,Jordan J E,et al.Basal nitric oxide exprsses endogenous cardio

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