粒體DNa片段誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化

1、    粒體DNa片段誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化            摘 要 目的：探討線粒體DNA(mtDNA)片段的惡性轉(zhuǎn)化效應(yīng)和轉(zhuǎn)化機(jī)制。方法：采用基因轉(zhuǎn)入技術(shù)，觀察經(jīng)mtDNA片段轉(zhuǎn)染后小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)在裸小鼠體內(nèi)的成瘤能力，并對(duì)形成的腫瘤進(jìn)行病理觀察；同時(shí)應(yīng)用熒光原位雜交(FISH)方法，觀察mtDNA片段在NIH3T3細(xì)胞核內(nèi)的整合情況。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后1周,18%20%的NIH3T3細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)有目的基

2、因探針的陽性雜交信號(hào)；轉(zhuǎn)染后2周的培養(yǎng)細(xì)胞在裸小鼠皮下形成腫瘤的能力為100%(8/8)；且形成腫瘤的病理表現(xiàn)與纖維肉瘤的特征相一致。結(jié)論：mtDNA片段在核基因組中的自發(fā)整合是促發(fā)細(xì)胞癌變的又一因素。    關(guān)鍵詞：DNA,線粒體 成纖維細(xì)胞 小鼠,裸 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代試驗(yàn)    目前，關(guān)于腫瘤病毒或活化癌基因能誘導(dǎo)良性細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的研究已非常普遍。但作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞唯一核外基因組的線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)，是否也具有類似于腫瘤病毒那樣的活性尚缺乏有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)1，2。前期研究

3、發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞核基因組中存在mtDNA的同源序列。這些同源序列的來源及其在細(xì)胞癌變中的作用也僅僅是理論上的推測(cè)。我們通過mtDNA片段向小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)入的方法，探討了mtDNA片段的惡性轉(zhuǎn)化效應(yīng)及轉(zhuǎn)化機(jī)制。    材料與方法    1.主要試劑：PCR試劑盒,PCR產(chǎn)物純化試劑盒,PCR地高辛(DIG)探針合成試劑盒，抗DIG熒光抗體均為德國寶靈曼公司產(chǎn)品。    2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 選大小相近的BALB/C裸小鼠16只,體重13 g±5 g

4、，用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞體內(nèi)接種實(shí)驗(yàn)。    3.受體細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)：選用NIH3T3(美國，NIH)為受體細(xì)胞。將3×105細(xì)胞接種于100 ml細(xì)胞培養(yǎng)方瓶中,加入含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 5% CO2孵箱中無菌培養(yǎng)，每3天傳代1次。    4.目的mtDNA基因片段的PCR擴(kuò)增與純化： 引物1：5-ATCTTAATGGCACATGCAGC-3,引物2：3-TCTAATGTGTACGTTCGTTCGTAG-5, 擴(kuò)增包含Co、tRNALys、ATPase 6共3個(gè)完整基因在內(nèi)的1 62

5、6 bp mtDNA片段。用此片段作為轉(zhuǎn)染目的基因片段。以人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞(取自中科院上海細(xì)胞所)mtDNA為模板，擴(kuò)增的mtDNA基因片段，代表癌細(xì)胞來源的mtDNA片段；以1名無腫瘤及也無其他遺傳病家族史的45歲健康男性外周血白細(xì)胞mtDNA為模板，擴(kuò)增的mtDNA片段，代表正常細(xì)胞來源的mtDNA片段。mtDNA模板的制備及PCR擴(kuò)增方法參見文獻(xiàn)3，4。 PCR產(chǎn)物的純化參照試劑盒說明書進(jìn)行。    5.實(shí)驗(yàn)分組：組：NIH3T3細(xì)胞不經(jīng)任何因素處理空白對(duì)照；組: NIH3T3細(xì)胞不加mtDNA片段轉(zhuǎn)染假轉(zhuǎn)染對(duì)照； 組:NIH3T3細(xì)胞加

6、癌細(xì)胞來源的mtDNA片段轉(zhuǎn)染； 組: NIH3T3細(xì)胞加白細(xì)胞來源的mtDNA片段轉(zhuǎn)染。    6.基因轉(zhuǎn)染:將0.8 ml細(xì)胞懸液(4×106/ml)轉(zhuǎn)移至無菌轉(zhuǎn)染杯中，加入10 g mtDNA片段(30 l TE液溶解，組只加30 l空白TE液),混勻，室溫靜置10 min；將轉(zhuǎn)染杯置于基因脈沖儀(Bio-Rad)的放電槽中，800 V電擊0.4 ms，室溫靜置10 min，分裝重新培養(yǎng)，倒置顯微鏡下對(duì)比觀察各組細(xì)胞的增殖活力和飽和密度變化。    7.染色體制備及G顯帶：取組和轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1周的、組

7、細(xì)胞，參照吳秉銓介紹的方法5進(jìn)行。結(jié)果判斷：以20對(duì)染色體核型為二倍體，多于或少于20對(duì)者為異倍體。    8.熒光原位雜交(FISH)：采用步驟4的白細(xì)胞mtDNA為模板，引物1和引物2配對(duì)，DIG標(biāo)記PCR擴(kuò)增合成1 626 bp mtDNA探針并純化；參照路建平介紹的方法6進(jìn)行FISH分析。    9.轉(zhuǎn)化細(xì)胞裸小鼠體內(nèi)接種及病理觀察：組和轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2周的、 組細(xì)胞各取4×106個(gè),用0.8 ml含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮,等分后接種于裸小鼠右腋部皮下,每組2只。作好標(biāo)記，飼養(yǎng)2

8、3個(gè)月，觀察裸小鼠的存活及腫塊生長情況。對(duì)形成腫瘤進(jìn)行大體形態(tài)、光鏡及電鏡觀察。首次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行包括轉(zhuǎn)染、接種在內(nèi)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。    10.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用卡方檢驗(yàn)。    結(jié)果    1.mtDNA目的基因片段及DIG標(biāo)記探針電泳分析：兩種細(xì)胞來源的mtDNA模板經(jīng)擴(kuò)增后,獲得了1 626 bp的目的基因片段和DIG標(biāo)記的探針,純化后引物二聚體及多余的單核苷酸消失(1)。    2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長特性變化：組和組細(xì)胞呈單層生長；而組

9、和組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后部分死亡，48 h后殘余細(xì)胞恢復(fù)增殖活力，達(dá)到飽和密度時(shí)呈重疊生長。    1.SPC-A-1細(xì)胞mtDNA為模板擴(kuò)增的目的基因片段；    2.正常人白細(xì)胞mtDNA為模板擴(kuò)增的目的基因片段；    3.正常人白細(xì)胞mtDNA為模板擴(kuò)增的DIG標(biāo)記探針；    4. DNA/Hind III Marker。    1 1 626 bp mtDNA目的基因片段及DIG標(biāo)記探

10、針電泳譜    3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞染色體倍性變化：組和組細(xì)胞染色體核型中60%為二倍體，40%為異倍體；而組和組細(xì)胞染色體核型中異倍體達(dá)90%以上。    4.FISH分析：組和組細(xì)胞中期染色體或間期核中均無人mtDNA探針的陽性雜交信號(hào)，而組和組部分細(xì)胞中期染色體或間期核中出現(xiàn)了陽性雜交信號(hào)(25)；組陽性率為20%，組陽性率為18%，兩組間差異無顯著性。    5.轉(zhuǎn)染細(xì)胞在裸小鼠體內(nèi)的成瘤能力：組和組細(xì)胞在裸小鼠皮下形成腫瘤陽性率為0(0/8)；而組和組細(xì)胞在裸小鼠皮下形成腫

11、瘤陽性率為100%(8/8)。    6.形成腫瘤的病理變化：組和組細(xì)胞的形成腫瘤。大體形態(tài)上,表面凹凸不平，呈分葉狀，局部有壞死現(xiàn)象，解剖觀察可見皮下的分葉結(jié)節(jié)樣腫塊(6,7)，包膜不完整，與周圍組織有粘連，腫塊的切面呈灰白色，質(zhì)地細(xì)膩，似魚肉樣，各臟器未見轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)灶。光鏡下見梭形細(xì)胞相互交織，排列紊亂，瘤細(xì)胞豐富，大小不一，極性消失，具有顯著的異型性，核分裂象多，膠原纖維和血管少見，瘤細(xì)胞之間可見少量脂肪細(xì)胞。此外，瘤細(xì)胞對(duì)鄰近肌組織有明顯的侵襲現(xiàn)象(8,9)。電鏡下見瘤細(xì)胞核大，畸形，核膜凹凸不平，核染色質(zhì)分布不均，核仁大，可見較多的雙核仁，細(xì)胞粗

12、面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，并有囊狀擴(kuò)張，線粒體較豐富，但發(fā)育不良，少量細(xì)胞胞質(zhì)中可見肌微絲，細(xì)胞間隙較明顯，其中可見極少量膠原纖維(10，11)。    2，3 、組細(xì)胞中期染色體或間期核中無人mt DNA探針的陽性雜交信號(hào) FISH×1 200 4，5 、組部分細(xì)胞中間染色體或間期核中出現(xiàn)了陽性雜交信號(hào)(箭頭所示) FISH×1 200 6 組mt DNA-3T3細(xì)胞裸小鼠皮下形成腫瘤 7 組mt DNA-3T3細(xì)胞裸小鼠皮下形成腫瘤 8 組細(xì)胞核分裂象多，異型性顯著，瘤細(xì)胞間可見較多脂肪細(xì)胞，膠原纖維少 HE×400 9 組細(xì)胞核分

13、裂象多，異型性顯著，瘤細(xì)胞侵襲鄰近肌組織 HE×400    10 組：瘤細(xì)胞核大，畸形，雙核仁，核膜凹凸不平 ×4 000    11 組瘤細(xì)胞核/質(zhì)比值明顯增大，畸形核，核膜凹凸不平 ×4 000    討論    1.mtDNA片段的惡性轉(zhuǎn)化效應(yīng)：線粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唯一含有自身遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器,同時(shí)，它又是各種損傷因子作用的敏感部位。因此，細(xì)胞中線粒體損傷導(dǎo)致其中的遺傳物質(zhì)即mtDNA釋放事件可能

14、時(shí)有發(fā)生。 那么，這些游離于細(xì)胞質(zhì)中的mtDNA片段是否也具有類似于腫瘤病毒或活化癌基因那樣的致癌活性呢？國內(nèi)外已對(duì)此問題引起了重視7。我們?cè)趦纱沃貜?fù)性研究中均發(fā)現(xiàn)，經(jīng)mtDNA片段轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞(簡稱mtDNA-3T3)，在體外培養(yǎng)2周后接種于裸小鼠皮下，歷時(shí)23個(gè)月， 都長出了瘤結(jié)節(jié)，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染或假轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞，在裸小鼠皮下均未形成瘤結(jié)節(jié)。 表明mtDNA片段能使NIH3T3細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，并能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得體內(nèi)成瘤能力。病理觀察發(fā)現(xiàn),mtDNA-3T3細(xì)胞所形成的瘤結(jié)節(jié)，與纖維肉瘤的病理特征一致8。表明mtDNA片段能使NIH3T3細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。我們通過設(shè)立癌細(xì)胞來源

15、和正常細(xì)胞來源的mtDNA片段進(jìn)行轉(zhuǎn)染的對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的轉(zhuǎn)化活力差異無顯著性。由此推測(cè)，生理狀態(tài)下任何細(xì)胞的mtDNA游離片段都可能具有潛在的轉(zhuǎn)化活性。    2.mtDNA片段誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)理：眾多研究表明，外源性核酸誘發(fā)宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,是通過遺傳信息在宿主細(xì)胞核DNA中整合來實(shí)現(xiàn)的9。整合結(jié)果使宿主細(xì)胞形成了轉(zhuǎn)化基因，從而產(chǎn)生一種或數(shù)種轉(zhuǎn)化蛋白。這些轉(zhuǎn)化蛋白在促發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和維持細(xì)胞的轉(zhuǎn)化狀態(tài)方面發(fā)揮了重要作用。通常，在腫瘤病毒感染宿主細(xì)胞3648 h就可以使宿主細(xì)胞發(fā)生明顯的轉(zhuǎn)化。我們發(fā)現(xiàn)，在mtDNA片段轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后第7 d時(shí)，mtDNA-3T3細(xì)胞染色體核型已發(fā)生了