蛋白質(zhì)的分離純化

1、蛋白質(zhì)的分離純化一、沉淀法沉淀法也稱溶解度法。其純化生命大分子物質(zhì)的基本原理是根據(jù)各種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異性來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致有效成分的溶解度發(fā)生變化。1、鹽析法鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液中析出。2、有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。3、蛋白質(zhì)沉淀劑蛋白質(zhì)沉淀劑僅對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素

2、和重金屬等。4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。5、選擇性沉淀法根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子作用下穩(wěn)定性不同的特點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)倪x擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中，從而達(dá)到純化有效成分的目的。二、吸附層析1、吸附柱層析吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動相構(gòu)成柱的一種層析方法。2、薄層層析薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質(zhì)涂布于載體上形成薄層，然后按紙層析操作進(jìn)行展層。3、聚酰胺薄膜層析聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附

3、作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強(qiáng)弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時(shí)，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續(xù)過程，就能導(dǎo)致分離物質(zhì)達(dá)到分離目的。三、離子交換層析離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。四、凝膠過濾凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能

4、進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部。當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時(shí)，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。五、親和層析親和層析的原理與眾所周知的抗原-抗體、激素-受體和酶-底物等特異性反應(yīng)的機(jī)理相類似，每對反應(yīng)物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應(yīng)中，特異的廢物（S）才能和一定的酶（E）結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物（E-S）一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，并產(chǎn)生復(fù)合物。而親和層析與酶-底物反應(yīng)不同的是，前者進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，配體（類似底物）是固相存在；后者進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，底物呈液相存在。實(shí)質(zhì)上親和層析是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等）以

5、共價(jià)鍵的方式固化到含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M（如活化瓊脂糖等）上，制成親和吸附劑M-L，或者叫做固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質(zhì)的能力。因此，當(dāng)把固相載體裝人小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體積）后，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時(shí)樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就可借助靜電引力、范德瓦爾力，以及結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質(zhì)則被起始緩沖液洗滌出來，并形成了第一個(gè)層析峰。然后，恰當(dāng)?shù)馗淖兤鹗季彌_液的pH值、或增加離子強(qiáng)度、或加人抑制劑等因子，即可把物質(zhì)S從固相載體上解離下來，并形成了第M個(gè)層析峰。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質(zhì)滿意地分離開。如果樣品液中存

6、在兩個(gè)以上的物質(zhì)與固相載體具有親和力（其大小有差異）時(shí)，采用選擇性緩沖液進(jìn)行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經(jīng)再生處理后，可以重復(fù)使用。上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具有較強(qiáng)的吸附選擇性和較大的結(jié)合力。而后者的配體則一般為簡單的小分子物質(zhì)（如金屬、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率。六、聚焦層析聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相

7、為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。聚焦層析原理可以從pH梯度溶液的形成、蛋白質(zhì)的行為和聚焦效應(yīng)三方面來闡述。1、PH梯度溶液的形成在離子交換層析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實(shí)現(xiàn)的。例如，當(dāng)使用陰離子交換劑進(jìn)行層析時(shí)，制備pH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室中裝高pH溶液，而在另一室裝低pH極限溶液，然后打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續(xù)不斷地流過柱體。這時(shí)從柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當(dāng)洗脫液流進(jìn)多緩沖交換劑時(shí)，由于交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團(tuán)，故pH梯度溶液可以自動形成。例如，當(dāng)柱中裝陰離子交換劑PBE94（作固定相）時(shí)，先用起

8、始緩沖液平衡到pH9，再用含pH6的多緩沖劑物質(zhì)（作流動相）的淋洗液通過柱體，這時(shí)多緩沖劑中酸性最強(qiáng)的組分與堿性陰離子交換對結(jié)合發(fā)生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，柱內(nèi)每點(diǎn)的pH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時(shí)間，從層析柱頂部到底部就形成了pH69的梯度。聚焦層析柱中的pH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進(jìn)行，pH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的pH卻由9逐漸降至6，并最后恒定于此值，這時(shí)層析柱的pH梯度也就消失了。2、蛋白質(zhì)的行為蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的等電點(diǎn)（PI）和層析柱中的pH值。當(dāng)柱中的pH低于蛋白質(zhì)的PI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，且不與陰離于交換劑結(jié)合。而隨著洗脫劑向

9、前移動，固定相中的pH值是隨著淋洗時(shí)間延長而變化的。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動至環(huán)境pH高于其PI時(shí)，蛋白質(zhì)由帶正電行變?yōu)閹ж?fù)電荷，并與陰離子交換劑結(jié)合。由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境pH 再次低于PI時(shí)，它又帶正電荷，并從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復(fù)進(jìn)行，于是各種蛋白質(zhì)就在各自的等電點(diǎn)被洗下來，從而達(dá)到了分離的目的。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，它們在被離子交換劑結(jié)合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先后次序是按等電點(diǎn)排列的。3、聚焦效應(yīng)蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。pH梯度的形成是聚焦效應(yīng)的先決條件。如果一種蛋白質(zhì)是加到已形成pH梯度的層析柱上

10、時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動，它將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處。從此位置開始，其蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出。若在此蛋白質(zhì)樣品被洗出前，再加人第二份同種蛋白質(zhì)樣品時(shí)，后者將在洗脫液的作用下以同樣的速度向前移動，而不被固定相吸附，直到其遷移至近似本身等電點(diǎn)的環(huán)境處（即第一個(gè)作品的緩慢遷移處）。然后兩份樣品以同樣的速度遷移，最后同時(shí)從柱底洗出。事實(shí)上，在聚焦層析過程中，一種樣品分次加人時(shí)，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的時(shí)間進(jìn)行聚焦，剩余樣品還可再加到柱上，其聚焦過程都能順利完成，得到的結(jié)果也是滿意的。七、氣相色譜多種組分的混合樣品進(jìn)人色譜儀的氣化室氣化后呈氣

11、態(tài)。當(dāng)載氣流入時(shí)，氣化的物質(zhì)被帶人色譜柱內(nèi)，在固定相和流動相中不斷地進(jìn)行分配在理想狀態(tài)下，溶質(zhì)于氣-液兩相間的分配可用分配系數(shù)Kg描述。當(dāng)分配系數(shù)小時(shí)，溶質(zhì)在柱中就停留時(shí)間短，也即滯留因子（Rf）大，所以它將首先從色譜柱流出而進(jìn)人鑒定器，經(jīng)放大系統(tǒng)放大后，輸出訊號便在記錄儀中自動記錄下來，這時(shí)呈現(xiàn)的圖形為色譜圖，亦稱色譜峰；當(dāng)分配系數(shù)大時(shí)，溶質(zhì)在柱中停留時(shí)間就長，其色譜圖在記錄儀上后出現(xiàn)。由于不同物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，所以將一混合樣品通過氣-液色譜柱時(shí)，其所含組分就可得到分離。氣相色譜柱效率高、分辨率強(qiáng)的重要原因是，理論塔板數(shù)（N）大。毛細(xì)管氣相色譜的N可達(dá)1056。增加理論塔板數(shù)和降低樣品組

12、分的不同分子在展層中擴(kuò)展程度（速率理論），就可明顯地提高柱效。以下將討論塔板理論和速率理論對柱效的影響：1、塔板理論塔板理論是將色譜假設(shè)為一個(gè)蒸餾塔，塔內(nèi)存在許多塊塔板，樣品各組分在每塊塔板的液相和氣相間進(jìn)行分配，在柱內(nèi)塔板間高度H（即理論塔板高度）一定時(shí)，在有效范圍內(nèi)，柱子越長，N也就越大，樣品各組分分配次數(shù)也就越多，分辨率自然提高；若柱長一定時(shí)，塔板理論高度H越小，就越能增加樣品各組分的分配次數(shù)，進(jìn)而提高其分辨率。因此 N=L/H 在線性分配和忽略塔板間縱向擴(kuò)散的條件下，根據(jù)樣品組分的保留時(shí)間tr、峰寬W或半峰高寬度2Xi，Martin導(dǎo)出了計(jì)算N的公式，樣品組分峰寬度值越小，理論塔板數(shù)越

13、高。實(shí)際上，進(jìn)行色譜分析時(shí)，峰寬度值的大小是衡量分辨率高低的一個(gè)尺度。2、速率理論根據(jù)塔板理論，在H（塔板理論高度）一定時(shí)，增加柱長可以提高柱效。但是，柱子過長，將會延長分析時(shí)間，降低檢測的靈敏度。所以實(shí)踐中應(yīng)設(shè)法降低H，提高柱效。速率理論主要是分析同一樣品的不同分子，在色譜柱中遷移速度差異所引起色譜峰的擴(kuò)張程度。而渦流擴(kuò)散、縱向分子擴(kuò)散和質(zhì)量傳遞（包括流動相傳質(zhì)和固定相傳質(zhì)）等因子與速率理論值（H）的密切關(guān)系可用下面的公式表示：H=A+B/U+C渦流擴(kuò)散（A）是由于樣品組分隨著流動相的移動通過固定相顆粒不均勻的色譜柱時(shí)，引起同一組分的不同分子在流動相中形成不規(guī)則的"渦流"

14、，致使色譜峰變寬、柱效降低。如固定相顆粒均勻、直徑小時(shí)，則可降低"渦流"現(xiàn)象發(fā)生。縱向擴(kuò)散（B/U）亦稱分子擴(kuò)散項(xiàng)?？v向擴(kuò)散與樣品分子在色譜柱中的流暢程度（有無阻礙）、流動相的速度（U）等因子有關(guān)。因此，降低溶質(zhì)在流動相中擴(kuò)散系數(shù)和縮短溶質(zhì)在流動相中停留時(shí)間，均可降低縱向擴(kuò)散。傳質(zhì)阻力（C）：溶質(zhì)分子在氣相與氣液界面進(jìn)行交換所受的阻力，以及在進(jìn)入固定相液膜傳遞的差異性統(tǒng)稱傳質(zhì)阻力。傳質(zhì)阻力分別與固定相顆粒直徑的平方和固定相液膜厚度成正比關(guān)系。八、高效液相色譜高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液

15、相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進(jìn)行。高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。1、進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣器完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。2、輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.474.4×107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動相通過層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)

16、，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、pH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。3、分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為1050cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為25mm，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為510m粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）。固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性（如

17、硅膠表面的硅酸基團(tuán)基本已除去）、多孔性（孔徑可達(dá)1000?）和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基團(tuán)（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。4、檢測系統(tǒng)高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。（1）紫外檢測器該檢測器適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點(diǎn)：使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10?g/ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。（2）示差折光檢測器凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測