蛋白質(zhì)組分析中變形鏈球菌的酸耐受性代謝表型

1、蛋白質(zhì)組分析中變形鏈球菌的酸耐受性代謝表型 愛麗絲氯萊恩，德里克是哈蒂和尼古拉斯答雅克 牙科學院的研究，韋斯特米德千年研究所和口腔健康韋斯特米德中心，郵政信箱533，Wentworthville，NSW，澳大利亞2145 摘要 雙向凝膠電泳的蛋白質(zhì)組分析鏈球菌變形鏈球菌生長在一個穩(wěn)定的狀態(tài)在一個葡萄糖有限厭氧連續(xù)培養(yǎng)揭示了時出現(xiàn)的差異表達的生長pH值降低蛋白質(zhì)的數(shù)量從0到pH值pH值750 。在代謝蛋白表達的變化，一般限于3生化途徑：糖酵解，產(chǎn)酸的替代和支鏈氨基酸的合成。代表的蛋白質(zhì)與恩布登-邁爾霍夫-帕爾納斯途徑相關(guān)酶的所有景點的相對表達水平，以及在主要替代變形鏈球菌發(fā)酵酸途徑參與所有的酶，

2、但一，鑒定和測量。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)與最終產(chǎn)品和細胞產(chǎn)量的分析結(jié)合起來，進行了表型改變，允許變形鏈球菌增殖的消耗能量，在低pH值從細胞擠出多余的氫離子相一致，同時盡量減少不利影響，該結(jié)果從代謝偶聯(lián)的碳通量和NADH和丙酮酸生產(chǎn)在隨后的不平衡。在酶水平的變化與在最強的酸，甲酸，這是一個對丙酮酸轉(zhuǎn)移的結(jié)果既乳酸和支鏈氨基酸生產(chǎn)時變形鏈球菌在酸性環(huán)境下栽培的形成目標一致。 縮略語：2胃排空，雙向凝膠電泳;的ASB - 14，amidosulfobetaine - 14;研發(fā)，稀釋率;署署長，差異表達（值），IPG集團，固相pH梯度;新聞通訊社，胞內(nèi)多糖;的MALDI - TOF法，矩陣輔助激光解吸電離時間

3、飛行，PEP的，警校，磷酸：葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng);產(chǎn)品市場管理，肽質(zhì)量映射; YATP，ATP的產(chǎn)量，每摩爾ATP的細胞干重; YGlc，細胞產(chǎn)量，每摩爾葡萄糖細胞干重 齲齒引發(fā)的是與臨床相關(guān)產(chǎn)酸和耐酸細菌分泌和容忍的有機酸性發(fā)酵的碳水化合物代謝副產(chǎn)物。通過它們對牙齒琺瑯質(zhì)除鹽作用，這些有機酸都發(fā)起并有助于疾病的病因。在過去50年中，齲齒的研究集中于口腔鏈球菌，尤其是變形鏈球菌，目前接受的是與他的病（濱田斯萊德，1980年;哈珀萊歇，1984年開始相關(guān)的各種形式;萊歇，1986年;面包車烏特，1994年;車Ruyven等。，2000）。 許多研究一直致力于研究鏈球菌糖代謝，特別是生物化學和允許

4、變形鏈球菌產(chǎn)生酸和生存在口腔內(nèi)pH值低的生理適應(yīng)。從歷史上看，本研究采用了一種還原論的方法來研究，如酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)和代謝通量的改變（巖見及山田，1980年;漢密爾頓，1984年;山田，1987年;卡爾松和漢密爾頓，1996年; Quivey等生化過程基地。，2001）。一個最近的一些報告，但已較全面的戰(zhàn)略使用蛋白質(zhì)組分析功能來重新評估在變形鏈球菌耐酸機制。例如，通過雙向電泳（2 -胃排空的14C標記的細胞蛋白質(zhì)）的分析顯示了64個蛋白質(zhì)上調(diào)，以及49項下調(diào)，當細胞從震驚pH值pH值5至75 0。這些蛋白質(zhì)的身份仍有待確定（Svensäter等。，2000）。相關(guān)研究在18蛋白質(zhì)上調(diào)和1

5、2下調(diào)時，比較了S的2 -胃排空蛋白質(zhì)組種植了一批文化鏈球菌，沒有啟動的pH控制pH值，70和5 2。由質(zhì)譜分析，確定了27個蛋白質(zhì)，13人參與糖代謝的運輸和中部（威爾金斯等人。，2002）。在這后一份報告，變形鏈球菌是在收割和分析中指數(shù)的階段，在這階段，兩地文化的pH值下降到672和4分別。顯著不同的世代時間分別獲得10 h和66小時在兩個pH值（威爾金斯等人。，2002）。這是在培養(yǎng)一批pH值的變化作出了在蛋白質(zhì)難以觀測到的變化的了解，以評估有關(guān)pH值衡量，因為細胞培養(yǎng)一批收獲不斷應(yīng)對不斷變化的外部環(huán)境。相反，連續(xù)培養(yǎng)法在本研究使用具有讓細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下嚴格規(guī)定的條件采樣的優(yōu)勢，從而實現(xiàn)真

6、正的比較蛋白質(zhì)組分析時，個別參數(shù)更改。 在目前的研究中，變形鏈球菌蛋白質(zhì)組，穩(wěn)定增長狀態(tài)，在pH 7在人工唾液中定義的0，一直與細胞生長在pH為5比0。這種方法已被選定為模仿更容易與主機的比較在一個健康的人牙菌斑的條件。同時，在一個層面上，這一分析強調(diào)了在耐酸性的表型的適應(yīng)程度，它已在另一個顯示，在對蛋白質(zhì)表達水平的變化似乎只限于關(guān)鍵的代謝途徑;值得注意的是，糖酵解，產(chǎn)酸，和對支鏈氨基酸的合成。相對于以往的研究在無（Svensäter等。，2000），或少于18（威爾金斯等人。，2002年）在這些通路的蛋白質(zhì)進行檢測，本研究發(fā)現(xiàn)在這三個83的酶生化途徑。該數(shù)據(jù)與假設(shè)一致，即變形鏈球菌

7、適應(yīng)酸性環(huán)境，減少氫離子的生產(chǎn)，使用了一系列不同的戰(zhàn)略。這是如此，盡管對ATP對H +分泌和利用由此產(chǎn)生的碳同化過程解耦需要從流失。 菌株及生長條件。 變形鏈球菌LT11（道等人連續(xù)的文化。，1993）厭氧條件下生長在一個貧化率（四）0100 ± 0001的H - 1，在pH 70 ± 01或pH值50 ± 01養(yǎng)分限制為葡萄糖，如前面所述（雅克等人。，1979）。用萬用表中，沒有粘液，但修改為包括腺嘌呤，鳥嘌呤和尿嘧啶在20微克毫升- 1，15毫米和15 mM的磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀（錫松斯等。，1991）。分析表明，變形鏈球菌是有限的葡萄糖在D = 01的H -

8、 1，pH值都在0和7在pH 50，因為99和9989，分別是葡萄糖，在培養(yǎng)基為利用，而添加的氨基酸都仍然過剩（平均利用率為75，在pH 70，在pH 50 72）。 制備細胞蛋白質(zhì)。 當已經(jīng)達到穩(wěn)定狀態(tài)，在培養(yǎng)容器的細菌含量，收獲，清洗及凍干，然后等分（10毫克干重）的細胞經(jīng)mutanolysin（萊恩等人。，2003）。蛋白質(zhì)是要在酸性固相pH梯度（IPG集團）條（pH值40-67）如前面所述提取（萊恩等人分開。，2003年），除了1（瓦特/ V）的amidosulfobetaine - 14（ASB的- 14）和65毫米數(shù)碼地面電視的生產(chǎn)增加了一個修改為2解磷解胃排空。雖然這些試劑的加入

9、提高了蛋白質(zhì)可以隨時在2看出胃排空凝膠點的總數(shù)，將其列入選擇性抑制提取或一弱先前已經(jīng)表示，可視化和蛋白質(zhì)少數(shù)隨后分離/或確定在2胃排空凝膠（萊恩等人。，2003）。 蛋白質(zhì)是在基礎(chǔ)IPG膠條（pH值6-11）是從mutanolysin處理的細胞獲得兩部分溶程序分開。下面的細胞裂解液（12 000克，4，10分鐘）離心，細胞沉淀是儲存在-20 ° C和蛋白質(zhì)的沉淀上清于-20 °，15（重量/體積ç過夜）三氯乙酸。經(jīng)過離心（12 000克，4，10分鐘）和2名甲醇洗滌，沉淀的蛋白質(zhì)溶解在300微升1：1混合改性增溶液（無的ASB - 14）細胞及細胞器膜和增溶試劑（

10、Sigma - Aldrich公司），含1（5 / 5）劑Triton X - 100及2 mm丁基。被凍結(jié)的細胞沉淀解凍，再由超聲波懸?。ú继m森超聲波，50瓦，10x10秒，與彼此間爆裂冰制冷）在700同一溶解微升。核酸外切酶（150 U）的加入，在室溫（20-22 ° C下15分鐘的暫停），以降低任何的DNA。這兩個細胞體進行合并，在室溫（12 000克，20-22，10分鐘）離心。在此之前國際盛事基金，100微升碘乙酰胺（500毫米）的混合物中加入在室溫（20-22 ° C下）2小時 2胃排空。 為了分開2胃排空，是從075毫克重干細胞溶解在150微升修改到窄范圍2

11、-胃排空解磷解決方案之前，杯裝中提取細胞蛋白的量相當于酸性蛋白（pH值40-50，45-55和55-67）IPG膠條（Amersham公司生物科學），預(yù)先與350相同的修改2胃排空解磷解微升腫脹。對于基本的細胞蛋白，IPG膠條（pH值6-11;阿麥斯罕生物科技公司）首次改良2胃排空解磷解前腫脹，沒有的ASB - 14，但含10（5 / 5）2 -丙醇。細胞蛋白提取相當于1毫克的重量，然后干細胞杯裝上IPG膠條。此修改導(dǎo)致了更好的2 -胃排空的基本蛋白質(zhì)的決議。 蛋白質(zhì)主要集中在20 ° C時使用一個Multiphor第二電泳系統(tǒng)（Amersham公司生物科學）蛋白質(zhì)集中在狹窄的范圍I

12、PG膠條為1415 KVH的（100伏為7小時，由300伏后6小時，2小時1000，2500為2小時，3500 2 H和V V V總5000 V的25 h）和一個798 KVH的（100伏2小時，由300伏隨訪2小時，2小時1000，2500為2小時，3500 V V V總就廣泛的范圍IPG膠條12小時和6小時5000五）。繼上10-18不亞于維梯度的SDS - PAGE分離，凝膠進行染色與Sypro紅寶石的圖像分析，然后被'雙染'通用模塊構(gòu)建與考馬斯亮藍的G - 250為現(xiàn)貨切除，胰蛋白酶消化和質(zhì)量光譜分析（萊恩等人。，2003）。 1998年第03 Sypro紅寶石染2凝膠

13、蛋白斑點胃排空高度重復(fù)性觀察樣品間從同一生長pH（數(shù)據(jù)未顯示）獲得。 密度/體積，或差異表達（DE）的價值（任意單位）各Sypro紅寶石染蛋白質(zhì)點，決心用軟件Z3的（Compugen）。在這項研究中，與此相關(guān)的量化形式主要來源是錯誤的2 -重復(fù)性胃排空顯示自己，因為生物的變化是通過對文化的恒化器，以減少使用的細菌。這2 -胃排空顯示是錯誤的主要來源是通過比較隨機選擇的25個蛋白點，從廣泛的范圍IPG膠條（pH值40-70）分隔兩地顯示選擇署署長胃排空值確認。從樣本一式三份等價蛋白連續(xù)培養(yǎng)3個重復(fù)每個點進行了分析。這些數(shù)據(jù)證實，2胃排空是錯誤的決定署署長值的主要來源。因此，各一式三份的pH值在細

14、胞生長的實驗樣本為所有2胃排空用于分析，并在現(xiàn)場的蛋白質(zhì)表達水平的增加是根據(jù)在平均DE值的變化。 蛋白異構(gòu)體。 這個詞'異構(gòu)體'是用在這里來描述多收取的蛋白質(zhì)2 -胃排空凝膠，那里的平均觀察從第二個（經(jīng)SDS - PAGE）尺寸計算出每種形式存在forms先生偏離5或以下，和那里是沒有肽質(zhì)量退化任何形式的截斷或映射的證據(jù)。 質(zhì)譜分析。 胰蛋白酶在凝膠消化，濃縮，低拷貝數(shù)蛋白脫鹽，和基質(zhì)輔助激光解吸電離時間飛行（的MALDI - TOF）質(zhì)譜分析，進行（如前面所述）在每個點的蛋白質(zhì)是獨特的表達差異，或在pH 70或pH值50，或者形成利益的代謝途徑（萊恩等人的一部分。，2003）

15、。大規(guī)模從復(fù)制在兩個增長pH值2胃排空凝膠，每個蛋白質(zhì)點光譜分析，用確認已經(jīng)由Z3的軟件匹配蛋白質(zhì)的身份。 蛋白質(zhì)鑒定。 肽質(zhì)量映射（產(chǎn)品市場管理）的蛋白質(zhì)進行了分析，如前面所述，使變形鏈球菌UA159的重疊群使用的6個基因組10月6日2001年在所有六個閱讀框（萊恩等人翻譯的下載。，2003年） 。最初的6個重疊群中使用了這種方式在這些重疊群發(fā)現(xiàn)一些基因沒有在最后的注釋本中。 氨基酸分析。 在花中的游離氨基酸含量進行分析柱前6 - aminoquinolyl -的N -羥基氨基甲酸酯衍生化，采用水AccQFluor試劑盒（科恩及米肖，1993;科恩及DeAntonis，1994）。氨基酸衍生

16、物進行了分離和量化反相（C18柱）高效液相色譜法，使用水AccQTag列（15 cmx39毫米號），根據(jù)制造商的協(xié)議（科恩，2001）。高效液相色譜法進行了一水聯(lián)盟2695分離模塊，474熒光檢測器和2487雙升吸光度檢測器，串聯(lián)。控制和分析軟件水域賦權(quán)臨模塊。色氨酸進行了分析紫外檢測，熒光檢測和所有其他氨基酸。 代謝產(chǎn)物分析。 葡萄糖的濃度，醋酸，乙醇，甲酸和乳酸在穩(wěn)態(tài)測量中目前使用適當?shù)臋z測試劑盒（羅氏enzymically），根據(jù)制造商的指示（哈蒂及漢德利，1988）。胞內(nèi)多糖的累積金額（IPS）的測定等人的DiPersio碘化鉀法。 （1974年）。 一個穩(wěn)態(tài)組合連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)，縮小范圍

17、IPG膠條允許檢測，對Sypro紅寶石染2胃排空凝膠，155個蛋白點差異表達的細胞中表達上調(diào)耐酸增長超過15倍變形鏈球菌在pH 50。其中，123人確定了質(zhì)譜分析，并發(fā)現(xiàn)與53個法規(guī)和相關(guān)/或壓力的反應(yīng)途徑（萊恩等人。，2004）。其余70個蛋白點都與代謝;大部分是與糖酵解有關(guān)的，替代產(chǎn)酸和支鏈氨基酸的合成（表1）。    表1。代謝蛋白表達的差異變形鏈球菌生長在pH 70或pH值50 葡萄糖的吸收和質(zhì)子擠壓 在pH 70，變形鏈球菌優(yōu)先運輸?shù)拿傅牡诙哂H和力物磷酸葡萄糖：葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PEP的，警校），清理垃圾葡萄糖分子（埃爾伍德等人的能力。，1979）

18、。兩個這樣的系統(tǒng)存在變形鏈球菌：EIIman，已得到很好的特點，并EIIglc，它們的存在主要是基于對生理性意見（Vadeboncoeur，1984;內(nèi)龍Vadeboncoeur，1987）。然而，連續(xù)的文化研究表明，變形鏈球菌是完全缺乏EIIman和EIIglc活動在pH 50（Vadeboncoeur等。，1991）。在這個酸性pH值，細菌優(yōu)先利用非警校葡萄糖通透系統(tǒng)（漢密爾頓和圣馬丁，1982年; Dashper與雷諾，1990年;巴克利和漢密爾頓，1994年），同時保持增加其質(zhì)子水平較堿性細胞質(zhì)-移位F1F0 - ATP酶（漢密爾頓和巴克利，1991年; Cvitkovitch等。，1

19、995）。在最近的變形鏈球菌基因組注釋，但沒有確定具體的基因編碼葡萄糖通透（Ajdi等。，2002）。 質(zhì)譜分析沒有發(fā)現(xiàn)任何與固有膜中變形鏈球菌葡萄糖攝取的蛋白質(zhì)。由于未能檢測革蘭氏陽性菌固有的疏水膜蛋白變性是一種帶有2胃排空蛋白質(zhì)組分析（萊恩等人共同的問題。，2003）。盡管有此限制，兩個細胞質(zhì)組成形式，EIIABman（ManL）的EIIman PEP的，警察訓練學校，被確定（圖1，表1）。不幸的是，這兩種形式，對16 060名議員和14 940 ± 80 ± 30，與電點444 ± 005和446 ± 002，分別為（6只），分別為C -末端截斷。

20、他們只代表了部分蛋白質(zhì)EIIA，肽質(zhì)量指紋以來覆蓋區(qū)域僅限于EIIA（數(shù)據(jù)未顯示）。雖然EIIman人教版，警校EIIABman組件已申報為組成型表達變形鏈球菌（Vadeboncoeur，1984年），該蛋白質(zhì)被截斷的性質(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)嚴重限制了觀察到的68倍下降的解釋調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)在pH 50。這種限制也適用于是否下調(diào)反映了在PEP的葡萄糖，這些酸性條件下警校（圖1，表1減少使用問題）。    圖。 1。比較表達，在細胞生長，在pH 750 0或在運輸和葡萄糖糖酵解有關(guān)的變形鏈球菌蛋白。在橢圓柱代表的相對平均DE值（任意單位）每個蛋白點在2胃排空凝膠鑒定。可選擇丟

21、棄值大于100萬個是一個高度打破所示。在pH 50，蛋白質(zhì)點進行上調(diào)（綠色），下調(diào)（紅色），非差異表達（<15倍的差異，灰色），或獨特的表達（藍色），相對于pH值7 0。膜蛋白的蛋白質(zhì)組分析沒有發(fā)現(xiàn)有淡藍色矩形顯示。括號中的數(shù)字對應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)目表1;上標確定蛋白點的N端（1）或C -末端（二）片段。  相反，葡萄糖激酶（GLK級），所需的任何自由進入的方式通過一項通透細胞葡萄糖依賴ATP的磷酸化，上漲了由21倍，在pH調(diào)節(jié)50。但是，由于葡萄糖激酶擁有約80（波特等人的最佳pH值。，1982年），其相對活性和穩(wěn)定性都受到了細胞質(zhì)酸化在生長pH為50，其中內(nèi)部pH值會減少超過65

22、（Dashper與雷諾，1990年;漢密爾頓，1990年;石見等。，1992）。由于對糖酵解最適pH似乎是70（Dashper雷諾茲，1992年），在細胞質(zhì)pH值下降最可能解釋了為什么葡萄糖激酶是糖酵解的速率控制步驟時，細胞在pH 70是懸浮在低增長pH值在體外（巖見及山田，1980）。在觀察蛋白質(zhì)的增加可能因此只反映了需要克服這種抑制作用在細胞生長，在pH 50。 在變形鏈球菌的質(zhì)子移位F1F0 - ATP酶的擠出氫離子耐酸研究已受到相當?shù)闹匾?，是因為鏈球菌質(zhì)膜質(zhì)子滲透（班德等人。，1986）。阿75倍在（AtpA）和36在了F1這項復(fù)雜的組件（AtpC）亞基倍，觀察pH值增加50（圖1，表

23、1）。這種觀察與顯示的H + - ATPase的變形鏈球菌增加因應(yīng)環(huán)境酸化水平，以維持一個跨膜pH梯度（pH值）與細胞內(nèi)部，更多的堿性（貝利及以前的數(shù)據(jù)相一致侯爵，1991年;漢密爾頓和巴克利，1991年; Dashper與雷諾，1992年; Quivey等。，2001）。 糖酵解 葡萄糖進入細胞中，無論是人教版，警?；蛲ㄍ?葡萄糖激酶通路，進入恩布登-邁爾霍夫-帕爾納斯葡萄糖6磷酸糖酵解途徑，并轉(zhuǎn)化為丙酮酸。作者在對2個蛋白點確定胃排空凝膠（圖1，表1個不同途徑的酶每本）。 在該恩布登-邁爾霍夫-帕爾納斯通路上半年代謝中間體上形成的分析表明，6級的葡萄糖磷酸略有升高時，變形鏈球菌是在連續(xù)培養(yǎng)

24、生長在pH 55和D = 015的H - 1，而所有其他中間體的含量基本相同，直至并包括磷酸二羥丙酮和甘油三磷酸（巖見等。，1992）。在此基礎(chǔ)上，葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶（簡稱GPI增加一倍）和一個整體15倍的果糖1,6二磷酸醛縮酶（的FBA三個亞型水平的提高），類似于以前觀察在分批培養(yǎng)（威爾金斯等人。，2002年;圖。1，表1），可能反映了需要克服的細胞質(zhì)酸化對酶活性的影響，在pH 50。有些保健應(yīng)在行使這種簡化的解釋，但是，因為雙方都果糖6磷酸和甘油三磷酸可能需要作為轉(zhuǎn)酮酶底物（TKT公司），以增加核糖核酸的合成，在pH 50（見下文）。 不僅是在ATP的形式在糖酵解產(chǎn)生能量，但合成代謝反應(yīng)

25、也前兆。例如，一個特定的變形鏈球菌具有輔酶依賴性甘油三磷酸脫氫酶（GapN）繞過第一個ATP產(chǎn)生的糖酵解步驟，以生成還原（布朗Wittenberger，1971a合成反應(yīng)所需的NADPH;烏鴉Wittenberger，1979年;博伊德等。，1995;圖。1）。這種酶是必不可少的，因為變形鏈球菌具有既不屬于戊糖磷酸循環(huán)氧化的部分，也不是對輔酶NADH的所（布朗和Wittenberger，1971b減少transhydrogenase）。 20 - 34倍增加的輔酶依賴性甘油三磷酸脫氫酶的兩個異構(gòu)體量平均在pH 50，隨著對異構(gòu)體的含量變化與NAD依賴甘油三磷酸脫氫酶（GAPDH）和磷酸激酶（精

26、確制導(dǎo)組件），強調(diào)通過通路的兩個分支（圖1，表1）在確定碳通量的困難。但是，由于整體代表27倍，輔酶依賴性甘油三磷酸脫氫酶增加，在pH 50近兩倍于其他兩個備選糖酵解氧化酶每個分支的累積水平不斷上升，這表明，輔酶依賴性甘油三磷酸脫氫酶可能確實是最重要的是決定這個方向。這將是在與合成代謝活動所需，以維持高如蛋白質(zhì)和DNA在非最佳酸性細胞質(zhì)（烏鴉與Wittenberger，1979年; Quivey等的分子水平保持結(jié)構(gòu)完整性。，2001年;萊恩等人。 ，2004）。這種觀點是完全支持2 -胃排空凝膠在由一個高層次的轉(zhuǎn)酮酶（TKT公司）檢測pH值50。轉(zhuǎn)酮酶形成的糖酵解途徑重定向到磷酸戊糖途徑甘油三

27、磷酸果糖和6 -磷酸交界處，并最終合成核苷酸（圖1，表1）。 3種酶參與了3 -磷酸最終轉(zhuǎn)化為丙酮酸。其中第一，phosphoglyceromutase，是由6個代表在變形鏈球菌基因組（Ajdi等等位基因。，2002）。在這兩種蛋白質(zhì)的檢測產(chǎn)品，一（PmgY）是上調(diào)27倍，pH為50，而其他（PGM）中是在此pH值（圖1，表1缺席）。最后糖酵解酶，丙酮酸激酶（Pyk），4個亞型也上調(diào)在pH 50 24 - 71 - 23 - 78倍。丙酮酸激酶被認為是關(guān)鍵的速率限制在變形鏈球菌糖酵解調(diào)節(jié)步驟，因為它是由葡萄糖6磷酸激活的，而是由無機磷（山田和卡爾松，1975年b;阿貝和山田，1982年抑制;石

28、見與山田，1980）。然而，對在恩布登-邁爾霍夫-帕爾納斯糖酵解酶的主要形式前減少93，烯醇化酶（伊諾），連同其他輕微高先生和截斷形式的減少，預(yù)計將有顯著影響碳流在pH 50，尤其是在為烯醇化酶的最適pH值是75（BunickKashet，1981）。 由于在連續(xù)培養(yǎng)變形鏈球菌生長，是衡量血糖人教版，警校活動缺乏在pH 50（Vadeboncoeur等。，1991年），磷酸無須啟動該攝取葡萄糖的磷酸化級聯(lián)系統(tǒng)。最后三個糖酵解酶的水平，在pH為50與1的磷酸減少池，因為烯醇化酶水平的降低，整體28倍，丙酮酸激酶的四個異構(gòu)體的增加，同時，一致將預(yù)期到二，磷酸丙酮酸沒有向任何集結(jié)磷酸。這個想法是支持

29、四個中間體，三磷酸，2磷酸，磷酸和測量在S丙酮酸，變形鏈球菌生長在pH值55和D = 015的H - 1，其中3人的水平 - 磷酸和磷酸減少，2 -磷酸這仍然未變，丙酮酸增加（巖見等人的數(shù)額。，1992）。這是由另一進一步研究，其中一個細胞內(nèi)pH值下降可以顯著提高丙酮酸：磷酸比（巖見及山田，1980）的支持。磷酸也是L -乳酸脫氫酶（山田和卡爾松，1975年b;山田，1987年）的抑制劑，這種代謝物如此之低的水平將允許更高的乳酸濃度在pH 50累積，如確實如此（表2，見下文）。    表2。生長pH值對產(chǎn)量和最終的代謝產(chǎn)物變形鏈球菌在S 數(shù)字代表了至少3確定的意思

30、。 YATP決心根據(jù)哈蒂及漢德利（1988）的假設(shè)。 NAD的再生 在變形鏈球菌，丙酮酸可以轉(zhuǎn)化成酸性終端產(chǎn)品（圖2）新品種。在有氧環(huán)境下，變形鏈球菌利用丙酮酸脫氫酶丙酮酸轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A（卡爾松等人。，1985）。盡管這種酶，應(yīng)根據(jù)本研究利用經(jīng)濟增長的厭氧條件不活躍，在兩個多酶丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的三個組成部分，乙偶姻脫氫酶E1的組成部分，（AcoB），和C -末端片段對二氫的S -乙酰轉(zhuǎn)移酶（AdhC），確定了2 -胃排空凝膠（圖2，表1）。  圖。 2。比較表達，在細胞生長，在pH 70或50，在NADH氧化變形鏈球菌參與蛋白質(zhì)和葡萄糖的替代使用6磷酸鹽。在橢圓柱代表的相對平均D

31、E值（任意單位）每個蛋白點在2胃排空凝膠鑒定。在pH 50，蛋白質(zhì)點進行上調(diào)（綠色），下調(diào)（紅色），非差異表達（<15倍的差異，灰色），或獨特的表達（藍色），相對于pH值7 0。膜蛋白的蛋白質(zhì)組分析沒有發(fā)現(xiàn)有淡藍色長方形所示，而在橢圓形的棕褐色鑒定以前，（萊恩等人。，2003）。括號中的數(shù)字對應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)目表1;上標確定蛋白點的N端（1）或C -末端（二）片段。 在厭氧條件下，在過量葡萄糖，L -乳酸是由L -乳酸脫氫酶（LDH）。在降低丙酮酸為L -乳酸，NADH的氧化為NAD和細胞的氧化還原平衡得以維持。但是，在厭氧條件下，當葡萄糖限制，這種細菌依靠丙酮酸甲酸裂解酶途徑，它有兩個分支

32、，導(dǎo)致無論對甲酸和乙酸或乙醇的形成（卡爾松和格里菲斯，1974;山田形成與卡爾松，1975年b;山田，1987）。乙醇分支包括兩個步驟，其中有2 NADH的氧化為2 NAD的。在變形鏈球菌，這兩個步驟，其中乙酰輔酶A是先轉(zhuǎn)換為乙醛，然后到乙醇，是由雙功能酶催化，酒精，乙醛脫氫酶（粘附）。在通路，一個額外的ATP的生成醋酸分公司為乙酰輔酶A，先轉(zhuǎn)換為磷酸鹽，然后乙酰乙酸，與隨之而來的ADP的轉(zhuǎn)化為ATP的影響。通過對醋酸和丙酮酸，甲酸裂解酶途徑適當使用乙醇分行，變形鏈球菌可以隨時調(diào)整NADH氧化實際需要。如果沒有進一步的合成代謝的最終產(chǎn)品轉(zhuǎn)移，由糖酵解產(chǎn)生甲酸金額相當于醋酸和乙醇總量。 蛋白質(zhì)組

33、分析顯示，在2胃排空凝膠檢測L -乳酸脫氫酶的兩個亞型被上調(diào)，在pH 525 0 - 17倍，而pH值在70的水平。這些值是類似于一共有17倍報告所指出的關(guān)于L -乳酸脫氫酶中變形鏈球菌的三個亞型2和胃排空凝膠口腔鏈球菌生長時的5個亞型無批次pH值控制文化（威爾金斯等人。，2001年，2002年）。在L -乳酸脫氫酶同工酶增加我們的研究中觀察到的是不太可能的解釋在根據(jù)（表2）酸性條件下生產(chǎn)的L -乳酸量127倍，盡管L -乳酸脫氫酶具有廣泛的在酸性催化活性的最佳pH值范圍0-652，類似的pH值范圍0-66細胞的細胞質(zhì)中的pH值增長5 50（Dashper與雷諾，1990年;漢密爾頓，1990

34、 ;石見等。，1992）。更有可能的解釋是，這種酶是糖酵解中間調(diào)節(jié)pH值在較低的增長（山田和卡爾松，1975年b;高橋等人。，1982年;山田，1987）。 雖然沒有在對丙酮酸甲酸裂解酶表達水平的變化是在目前的研究發(fā)現(xiàn)，由于沒有檢測到酶2 -胃排空凝膠（圖2，表1），酒精，乙醛脫氫酶同工酶的6人，平均下調(diào)70倍，在pH 50，而眾多的C -末端截短形式是在這個pH值或下調(diào)或丟失。醋酸激酶（AckA）在醋酸分支，也被下調(diào)的一個因素調(diào)節(jié)21。相比之下，磷酸轉(zhuǎn)水平的提高，在pH 50（角17倍;圖。2，表1）。盡管一般的蛋白質(zhì)表達減少整體觀察在丙酮酸甲酸裂解酶途徑這兩個分支2凝膠胃排空，增加數(shù)額甲酸

35、，醋酸，乙醇生產(chǎn)了在pH 50，隨著乙醇的水平為4 6倍，在pH大于70（見表2）。這個觀察可以解釋主要是由增加糖酵解率（漢密爾頓，1984年）需要生產(chǎn)的H +擠壓在pH 50（本德爾等ATP的影響。，1986;貝利和侯爵，1991年;漢密爾頓和巴克利，1991年;宮城等基地。，1994;史密斯等人。，1996）。事實上，有一個碳在pH 50徒勞的使用是在ATP的產(chǎn)量均減少測量反映，（YATP;哈蒂及漢德利，1988）9日至16日39克（干重）細胞每摩爾三磷酸腺苷，細胞產(chǎn)量（YGlc），從0到28151克（干重）每摩爾葡萄糖，當pH值下降的增長從細胞750到0（表2）。但顯然沒有阻止替代酸生產(chǎn)

36、，問題是是否在乙醇和丙酮酸甲酸，醋酸分支酶途徑酶在細胞水平降低成為越來越多的限制，在pH 50，這樣增強了流動丙酮酸通過L -乳酸脫氫酶途徑。 支鏈氨基酸的形成 甲酸鹽在下降：（乙+乙醇）的比例最高糖酵解從理論價值，10到1 056，觀察值pH值在50（見表2）。由于醋酸濃度為pH值都相同，在甲酸在pH 50相對減少變形鏈球菌建議，這是進一步代謝酸。替代方案的乙醇產(chǎn)量的增加被其他代謝過程，可以排除，因為酒精只能通過丙酮酸甲酸裂解酶途徑形成。比較蛋白質(zhì)組分析顯示，在一些對甲酸在pH 50的命運在于支鏈氨基酸的生物合成途徑，由于增加了與此氨基酸通路在pH 50（圖觀察單相關(guān)的酶。3和表1）。連接時

37、，由于異亮氨酸生物合成需要2 -乙酰，這是由絲氨酸蘇氨酸得到去酰胺酶銨（IlvA，歐共體.19）。絲氨酸形成了一個由碳循環(huán)的方式捐助甲酸。這兩個亮氨酸和纈氨酸生物合成，另一方面，依靠直接丙酮酸（圖3）。然而，歸根結(jié)底，支鏈氨基酸的生物合成需要合成的亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸都丙酮酸和NADPH。德這些氨基酸從頭合成兩種方式可以減少產(chǎn)酸，減少直接消除了丙酮酸和2 -乙酰現(xiàn)金等價物形式，間接由NADPH的（圖3）消費。此外，減少甲酸水平也降低了H +濃度，由于甲酸是一種強酸性（pKa值375）高于或者乳酸（pKa值386）或乙酸（pKa值475）。  圖。 3。比較表達，在細胞生長，在pH

38、 750 0或在支鏈氨基酸參與蛋白質(zhì)合成變形鏈球菌。在橢圓柱代表的相對平均DE值（任意單位）每個蛋白點在2胃排空凝膠鑒定。蛋白質(zhì)點上升，在pH 50（綠色），并下調(diào)調(diào)節(jié)pH值在70（紅色）。蛋白質(zhì)不能鑒定蛋白質(zhì)組分析，在淡藍色的矩形顯示。括號中的數(shù)字對應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)目表1。  在pH 50，四酮醇酸還原異構(gòu)酶異構(gòu)體（IlvC）被上調(diào)39 - 57 - 26 - 35倍，而支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ IlvE）和谷氨酰胺合成酶（GlnA）被上調(diào)27 - 87倍，分別為（圖3，表1）。對支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)品，2 oxoglutaric酸（-酮戊二酸），也比谷氨酸較弱酸，與28 pKa值和50，

39、而pKa值的22和4 2對谷氨酸的羧基。支鏈氨基酸會形成以來，所有3個氨基酸的生物合成一個額外的好處，涉及氨由谷氨酰胺合成酶的形成。這氨氣，加上從絲氨酸生產(chǎn)異亮氨酸生物合成的過程中，將提供一個緩沖在50，由于氨的反應(yīng)與H +形成（圖生長pH在酸性細胞質(zhì)中變形鏈球菌的替代機制3）。有趣的是，丙酮酸激酶活性有一個或鉀離子，或和一個不似乎不利于（阿貝與山田，1982年;山田，1987年; Pitty和雅克，1989）口腔鏈球菌生長高濃度的強制性要求。 雖然蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，在演唱會與酸和乙醇end產(chǎn)品分析，都對支鏈氨基酸含量formation consistent，在了連續(xù)culture medium

40、these氨基酸concentration僅為2，至pH值5higher在pH值大于70 0（數(shù)據(jù)未顯示）。不同于其他氨基酸在變形鏈球菌運輸系統(tǒng)，支鏈氨基酸的吸收了很好的研究，并已被證明是由質(zhì)子動力，推動它在細胞內(nèi)的高支鏈氨基酸水平的成果（Dashper雷諾茲，1990）。從這些細胞氨基酸損失是由于被動流出通過細胞膜（Dashper雷諾茲，1990）。由于剩余的支鏈氨基酸濃度每外約03毫米的連續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)定狀態(tài)，其細胞濃度將高達10毫米（Dashper與雷諾，1990）。因此，一個在pH 50增加了這些細胞的生物合成氨基酸不一定會已在細胞外水平提高的反映。另外值得一提的是，密碼子使用的分析表明，244中變形鏈球菌蛋白質(zhì)的氨基酸是支鏈氨基酸，這意味著將有一個很高的蛋白質(zhì)合成這些氨基酸生物合成的要求。 在其他生物合成途徑的改變 在個別蛋白表達水平的變化，即不完整的代謝途徑，還確定了2胃排空。這些是與形成葡萄糖1磷酸利用，繼從葡萄糖6磷酸由phosphoglucomutase（PgmA）轉(zhuǎn)換的第一次。一個C -末端截短的這種酶的形式，檢測pH值7