HPLC法測定對坐葉片中槲皮素的含量

1、HPLC法測定對坐葉片中槲皮素的含量周旭美，藍(lán)英妮(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，遵義市 563003)摘要 目的：建立高效液相色譜法測定對坐葉片中槲皮素含量的方法。方法：用Dikma-ODS C18色譜柱（250 mm×4.6mm ，5µm），流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（53：47），流速為1.0ml·min-1，檢測波長為370nm，柱溫35。結(jié)果：槲皮素檢測在1.31-9.17µg·ml-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9998），平均加樣回收率為97.81%，RSD為0.98（n=5）。結(jié)論：該方法用于測定對坐葉中槲皮素含量簡便

2、、快速、準(zhǔn)確，為建立對坐葉片的質(zhì)量控制方法提供科學(xué)依據(jù)。關(guān)鍵詞：對坐葉片 槲皮素 含量測定 高效液相色譜法 Determination of quercetin in Duizuoye Tablet by HPLCZhou Xu-mei, Lan ying-ne (Dept.of pharmacy,Zunyi medical college ,Zunyi 563003,China)Abstract Objective : To establish a method of HPLC determination of quercetin in Duizuoye Tablet. Method : H

3、PLC analysis was carried out on Dikma-ODSCI8 column(250 mm×46 mm，5µm) and the methanol- 0.4 phosphoric acid solution (53：47) as mobile phase，the flow rate was 1.0 ml·min-1, the detection wavelength was 370nm and the column temperature was 35. Results : The calibration curve was linear

4、 in the range of 1.319.17µg·ml-1 (r=0.9998). The average recovery was 97.81, with RSD of 0.98(n=5)Conclusion : The HPLC method is simple，rapid and accurate of the determination of quercetin in Duizuoye Tablet，and it can be used for the quality control of Duizuoye TabletKey word: Duizuoye T

5、ablet; quercetin ; determination ; HPLC對坐葉片是由對坐葉單味藥制成的片劑，具有清熱解毒，利濕止瀉的功效，用于胃腸濕熱所致的腹瀉、腹脹、腹痛、里急后重以及痢疾、急性胃腸炎等癥1。對坐葉來源于茜草科耳草屬植物長節(jié)糙耳草Hedyotis uncinella Hook. et Arn. Var. scabridaOldenlandia uncinella （Hook. et Arn.） O. Ktunze var. scabrida （Franch.） Hand.-Mazz.，其主要功能是祛風(fēng)利濕，健脾消積，清熱解毒；用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，小兒疳積，久瀉，痢疾，牙疳；

6、外用治皮膚瘙癢，結(jié)膜炎2。對坐葉化學(xué)成分有齊墩果酸、槲皮素和熊果酸等3。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是采用薄層色譜法測定齊墩果酸的含量，存在操作繁瑣，靈敏度較低，誤差大等缺點(diǎn)，本文選擇槲皮素作為測定指標(biāo)，建立高效液相譜法測定對坐葉片中槲皮素含量的方法，該方法目前尚未見報(bào)道。 1 材料與方法1.1 材料 高效液相色譜儀：島津LC10ATVP高效液相色譜儀；檢測器：島津SPD10AVP紫外檢測器；色譜柱：Dikma-ODS C18(250×4.6mm 5µm)；AUW120D電子天平（十萬分之一，日本島津公司）。槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：100081-200406）；對坐葉片

7、（貴州某藥廠，批號分別為20070701等）；色譜甲醇，其它試劑（鹽酸、磷酸等）為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 色譜條件 色譜柱為Dikma-ODS C18(250×4.6mm 5µm)；流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（53 ：47）；檢測波長370nm；流速為1.0ml* min-1；柱溫35；進(jìn)樣量為20µl。2.2 測定溶液制備對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品適量，加甲醇制成5µg·ml-1槲皮素溶液。2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，研細(xì)混勻，取 1.0g，精密稱定，置于磨口具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml、25%鹽酸

8、溶液10ml，密塞，稱定重量，水浴回流1.5h，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)充減失重量，搖勻，濾過，精密吸取5ml續(xù)濾液置于25ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45µm）過濾，即得。2.2.3 陰性對照溶液的制備 按制備工藝方法制備不含對坐葉的陰性樣品，再按上述供試品溶液制備的方法制備成陰性樣品溶液。2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性 分別精密吸取槲皮素對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各20l，注入高效液相色譜儀，記錄圖譜（見圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素對照品在某一保留時間內(nèi)出峰，在供試品圖譜上相同的保留時間內(nèi)也出現(xiàn)和對照品同樣的峰，且基線較平，與相近的雜質(zhì)峰分離完全，無雜質(zhì)峰干擾，陰

9、性對照溶液所得色譜圖上相應(yīng)保留時間無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性樣品溶液對測定無干擾.t/minA t/minB t/minCA對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液圖1 對坐葉中槲皮素含量測定HPLC圖2.4 線性關(guān)系 精密稱取槲皮素對照品13.1mg，加甲醇溶解并定容至100ml，搖勻，精密量取此溶液25ml，加甲醇稀釋并定容至100ml，搖勻，制成濃度為32.75µg·ml-1的儲備溶液；分別精密吸取儲備溶液1ml、2ml、3ml 、4ml、5ml、6ml、7ml，置25ml容量瓶中，加流動相稀釋并定容至刻度，搖勻；分別精密吸取上述溶液各20µl，注入高效液相

10、色譜儀，記錄色譜圖，以對照品濃度（µg·ml-1）為橫坐標(biāo)，測得峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程：Y=31339X-8145.7，r=0.9998。2.5 精密度和穩(wěn)定性取對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次進(jìn)行測定，結(jié)果RSD0.89%(n=5)，表明日內(nèi)精密度良好。取同一份對照品溶液于0,1，2,3d測定，結(jié)果測得峰面積RSD1.39%(n=4)，表明日間精密度良好。取供試品溶液于0，2，4，6，8h后測定峰面積，RSD1.24%(n=5) ,結(jié)果表明在8小時內(nèi)，供試品溶液中槲皮素的含量穩(wěn)定。2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品粉末（批號：20070701）5份，各約1

11、.0g，精密稱定，按項(xiàng)下的方法制備5份供試品溶液，依法測定，測得槲皮素的峰面積RSD0.91%(n=5)，表明該方法重現(xiàn)性好。2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量為538.70µg/g樣品粉末5份，每份約0.5g，精密稱定，分別精密加入槲皮素對照品溶液（365.20µg/ml）1ml，按按項(xiàng)下的方法制備5份供試品溶液，依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1，表明該方法具有較好的回收率。表1 供試品溶液中槲皮素的加樣回收率試驗(yàn)編 號樣品稱重量（g）樣品中含量（µg）加入對照品量（µg）峰面積 測得量（µg） 回收率 （%）平均回收率 （%）R S

12、D （%）123450.50450.50130.50110.50160.5005 271.77270.05269.94270.21269.62365.20365.20365.20365.20365.20124211122536122505123543122037 633.51 625.49 625.34 630.31623.10 99.05 97.32 97.3198.60 96.7997.810.982.8 樣品含量測定 分別精密稱取10批對坐葉片樣品，按按項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算該10批樣品中槲皮素的含量，結(jié)果見表2。表2 樣品含量的測定結(jié)果批號樣品量（g）峰面積 測定值（

13、µg/g）平均含量值（µg/g）200707012007070220070703200707042007070520070706200707072007080120070802200708031.05331.07561.06991.06881.06911.08221.05521.07361.07431.0862111623112651110770113484111834113214113052112164113946114879544.25537.54 531.99 544.69 537.15 536.75 549.94 536.02 543.96 542.11 540.4

14、3結(jié)果表明10批樣品的平均含量為540.43µg/g，每片片重規(guī)格為0.25g，平均每片含槲皮素135.11µg。3 討論 對坐葉片原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜法測定齊墩果酸含量1，方法繁瑣，本文采用槲皮素作為待測成分，以HPLC法定量測定方法簡便、結(jié)果可靠。根據(jù)參考文獻(xiàn)2,3，4，考察了不同比例的甲醇-0.4%磷酸溶液作為流動相，只有在甲醇-0.4%磷酸溶液（53 ：47）時，槲皮素峰形最佳，吸收峰分離度好，保留時間適中。 槲皮素存在形式有游離型和槲皮素-3-阿拉伯糖苷，要先經(jīng)水解為游離型后方可被提取和測定，本文采用加酸水解，水解條件選擇實(shí)驗(yàn)中，分別加入了5%、10%、25%的鹽酸溶液進(jìn)行比較，結(jié)果表明加入5%、10%鹽酸溶液，水解不完全，槲皮素含量低；而加入25%鹽酸溶液水解完全，槲皮素含量高，故選用加入25%鹽酸溶液。槲皮素溶于甲醇、乙醇，微溶于水，分別以甲醇、乙醇為提取溶劑進(jìn)行比較，結(jié)果表明了甲醇提取比乙醇提取完全，含量較高。對樣品水浴回流提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h進(jìn)行比較，