堿裂解法提取質(zhì)粒-配方,最好的說(shuō)明

1、堿裂解法提取質(zhì)粒一、基本概念 1質(zhì)粒：質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專(zhuān)指細(xì)菌、酵母菌和放線(xiàn)菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細(xì)菌除了染色體外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是質(zhì)粒(plasmid)。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱(chēng)為附加體(episome)，這類(lèi)質(zhì)粒能夠整合進(jìn)細(xì)菌的染色體，也能從整合位置上切離下來(lái)成為游離于染色體外的DNA分子。 目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是

2、閉合環(huán)狀DNA分子(簡(jiǎn)稱(chēng)cccDNA)。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量一般較小，約為細(xì)菌染色體的0.5%3%。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類(lèi)：較大一類(lèi)的相對(duì)分子質(zhì)量是40×106以上，較小一類(lèi)的相對(duì)分子質(zhì)量是10×106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類(lèi)：一類(lèi)是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有12個(gè)質(zhì)粒;另一類(lèi)是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬?lài)?yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬

3、松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬?lài)?yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。 在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)?？梢约喾N有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運(yùn)載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有5種內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)。如果將DNA片段插入EcoRI切點(diǎn)，不會(huì)影響兩個(gè)抗生素基因的表達(dá)。但是如果將DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切點(diǎn)，就會(huì)使抗四環(huán)素基因失活。這時(shí)，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細(xì)菌抗氨芐青霉素，但

4、對(duì)四環(huán)素敏感。沒(méi)有DNA插入片段的pBR322會(huì)使宿主細(xì)菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒(méi)有pBR322質(zhì)粒的細(xì)菌將對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒(méi)有抗氨芐青霉素基因和PstI切點(diǎn)。質(zhì)粒運(yùn)載體的最大插入片段約為10kb(kb表示為千堿基對(duì))。pGEX-4T1是pGEX載體系列的一種，載體圖如圖2所示，這類(lèi)載體是溶蛋白表達(dá)、純化和檢測(cè)為一體的整合系統(tǒng)。具有以下優(yōu)點(diǎn)：有一個(gè)可以用化學(xué)物質(zhì)（IPTG）誘導(dǎo)的高效表達(dá)的tac啟動(dòng)子；一個(gè)lacIq基因以便通用于所有E.coli宿主中；一個(gè)AmpiR基因以便于陽(yáng)性克隆的篩選。 pGEX-4T1載體示意圖2感受態(tài)細(xì)胞：重組D

5、NA分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無(wú)性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個(gè)導(dǎo)入過(guò)程及操作統(tǒng)稱(chēng)為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。 在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。 所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時(shí)也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬(wàn)倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，新鮮幼嫩的

6、細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。 制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15%的無(wú)菌甘油或-70保存（有效期6個(gè)月）。3.轉(zhuǎn)化:是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性?xún)?nèi)切酶和甲基化酶的突變株。轉(zhuǎn)化的方法：化學(xué)的方法(熱擊法)；使用化學(xué)試劑（如CaCl）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，

7、通過(guò)高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。二、堿裂解法質(zhì)粒提取的原理堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒，是從事分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室每天都要用的常規(guī)技術(shù)。下面是該法的提取原理:   堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；(N相當(dāng)于g/L，是當(dāng)量濃度)溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。 溶液I的作用任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過(guò)的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說(shuō)

8、起來(lái)不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入EDTA是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。     溶液II的作用這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，是為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳 

9、; 的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)镾DS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點(diǎn)：第

10、一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會(huì)斷裂。基因組DNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩。     溶液III的作用溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，與SDS的加入有關(guān)系。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專(zhuān)門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨

11、基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。 2 M的醋酸是為了中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀(guān)察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無(wú)

12、法快速?gòu)?fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來(lái)是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來(lái)其實(shí)沒(méi)有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。 酚/氯仿純化 不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實(shí)還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時(shí)間一長(zhǎng)就會(huì)因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個(gè)全面的介紹。酚（Phenol）對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用

13、遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來(lái)最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點(diǎn)，酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就會(huì)被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰

14、，也方便了水相的回收。     回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來(lái)。這時(shí)候如果放到20，時(shí)間一長(zhǎng)反而會(huì)導(dǎo)致大量鹽的沉淀，這點(diǎn)不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要過(guò)分小心了。高濃度的鹽會(huì)水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺(jué)發(fā)生了鹽的沉淀，就用70的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個(gè)小時(shí)以上，并用tip將沉淀打碎，就能得到好的樣品。得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進(jìn)行溶解，不然大量未降解的RNA會(huì)干擾電泳結(jié)果的。質(zhì)粒檢測(cè) 瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)

15、粒DNA時(shí)，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬(wàn)不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線(xiàn)性和開(kāi)環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線(xiàn)性DNA，不信的話(huà)你用EcoRI來(lái)線(xiàn)性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會(huì)看到線(xiàn)性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過(guò)度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時(shí)候抽提到的質(zhì)粒會(huì)有710條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。三、實(shí)

16、驗(yàn)步驟1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（可臨用前準(zhǔn)備，也可制備多管加甘油凍存-80）（1）從新鮮的DH5菌株平板上挑取一個(gè)單菌落，（接種到4ml LB液體培養(yǎng)基中）37，180rpm培養(yǎng)過(guò)夜。（2）次日按照1：100的比例轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物于20mlLB液體培養(yǎng)基當(dāng)中，37，180rpm培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.4-0.6。（3）取培養(yǎng)物1ml到1.5ml 離心管中，冰浴10min，5000rpm離心5min收集菌體。（4）棄上清，加入預(yù)冷的0.1M CaCl2 1ml 后旋起菌體（在渦旋器上振蕩），冰浴30min。（5）5，000rpm離心10min后棄上清，加入預(yù)冷的0.1M CaCl2 100ul。（6）溫

17、和混勻后4放置24-48h備用。2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（1）取制備好的感受態(tài)菌體，加入質(zhì)粒5ul（可變）。（2）冰浴30min后，42水浴熱激90s（溫度準(zhǔn)確，速度要快把握好時(shí)間）。（3）取出后再冰浴5min；加入800ul LB液體培養(yǎng)基。（4）37，150rpm復(fù)蘇1h。（5）取10ul培養(yǎng)物涂布于含有抗生素的LB（由質(zhì)粒的抗性決定），37倒置培養(yǎng)。（對(duì)照組不加抗生素）3質(zhì)粒提?。ɑ蛴迷噭┖刑崛。?）從4拿出長(zhǎng)滿(mǎn)菌體的LB平板，打開(kāi)培養(yǎng)皿，用在酒精燈上燒過(guò)的鑷子夾取100ul的吸頭挑取單菌落，之后把帶有菌落的吸頭放入帶有抗生素的LB液體培養(yǎng)基（4ml或10ml，認(rèn)真標(biāo)記）37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。（若是第

18、二天進(jìn)行二次活化，則按照1：20的比例接種培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，記得加抗生素）。（2）取1ml菌液加入1.5ml的離心管中，認(rèn)真標(biāo)記后把剩余的菌液凍存（0.5ml的菌液，0.5ml純的甘油，認(rèn)真標(biāo)記）12，000rpm離心5min收集菌體。（3）5000rpm離心5min收集菌體，棄上請(qǐng)后再離心5s,吸取殘余的上清。（4）向每個(gè)離心管中各加入100ul預(yù)冷的溶液,在混懸器上振蕩使菌體充分懸浮，分散。（在冰上）（5）再向每個(gè)離心管中各加入200ul新配制的溶液，緩慢倒轉(zhuǎn)幾次混勻。（在冰上）（6）向每個(gè)離心管中各加入150ul溶液，緩慢倒轉(zhuǎn)幾次混勻。（在冰上）（7）12，000rpm離心10

19、min，轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中。（8）向每個(gè)離心管中各加入酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），顛倒混勻后12，000rpm離心10min。（9）吸取上清（注意不要吸到中間層）到1.5ml離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，于-20放置20-30min（或室溫放置10min）12，000rpm離心10min，棄上清，（小心不要把質(zhì)粒倒掉）（10）加1ml 70乙醇洗滌沉淀（來(lái)回顛倒旋轉(zhuǎn)幾次），12，000rpm離心3min，棄上清，室溫干燥20min，將沉淀溶于20ul的TE或水中，-20備用。注：一般在第二步離心收集完菌體后再加入1mlSTE，充分洗滌菌體，12，000rpm，離心12min

20、。4質(zhì)粒檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳核酸DNA在PH高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。瓊脂糖具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不同大小的核酸分子利用凝膠的分子篩效應(yīng)得以分開(kāi)。實(shí)踐中觀(guān)察瓊脂糖凝膠中DNA是利用熒光染料溴化已錠（EB）將DNA染色。溴化已錠與DNA結(jié)合，在254nm波長(zhǎng)的紫外燈下呈現(xiàn)橙黃色的熒光條帶。（1）以配制濃度為1%膠為例：取一個(gè)50ml錐形瓶（制膠專(zhuān)用），加入0.5g瓊脂糖后加1×TAE至50ml放入微波爐內(nèi)加熱（火力中高，時(shí)間3min），待液體沸騰后拿出錐形瓶（注意不要燙住手），用吸取50ul的EB（1：1000）加入錐形瓶?jī)?nèi)。等到錐形瓶不燙手后向制膠板內(nèi)倒膠，高度不

21、要漫過(guò)制膠板沿，冷卻，待膠凝固后拔出梳子。（2）配制電泳液：取一個(gè)500ml的廣口瓶，加入10ml 50×TAE，加雙蒸水至500ml。（3）待膠板放進(jìn)電泳槽后向電泳槽內(nèi)加入配好的電泳液，高度漫過(guò)膠板1mm。 （4）點(diǎn)樣：拿出裁成長(zhǎng)條的稱(chēng)量紙光面向上（或一次性手套），用10ul移液器吸取3ul的質(zhì)粒，打在稱(chēng)量紙上，再用10ul移液器吸取2ul的上樣緩沖液和質(zhì)?；靹?，吸取混合液5ul打入點(diǎn)樣孔。（5）電泳：接通電源，電壓設(shè)定在80v（可變），開(kāi)始電泳。（6）凝膠系統(tǒng)成相：等到指示劑快跑到膠板前沿時(shí)關(guān)閉電源，拿出膠板，放在暗箱內(nèi)，打開(kāi)與暗箱相連的電腦，進(jìn)入攝像軟件，進(jìn)行攝像，然后保存照片

22、。注：DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比，因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過(guò)20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開(kāi)。此時(shí)電泳的遷移率不再依賴(lài)于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時(shí)，分子大小不宜超過(guò)此值。瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。      不同 濃度 瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍瓊脂糖濃度 /%  

23、60; 0.3    0.6    0.7    0.9    1.2    1.5    2.0線(xiàn)狀DNA大小/kb  60-5  20-1  10-0.8  7-0.5  6-0.4  4-0.2  3-0

24、.1四、溶液配方（詳細(xì)參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南）LB液體培養(yǎng)基：每配制1000ml加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g。LB固體培養(yǎng)基：每配制1000ml加入胰蛋白胨10 g、酵母提取物5g、NaCl 10g、瓊脂糖1.5g。溶液：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl (pH8.0)，10 mM EDTA (pH8.0)。溶液：0.2 M NaOH(臨用前用10 M貯存液稀釋)，10%SDS(現(xiàn)用現(xiàn)配)。溶液：60ml 5 M乙酸鉀，11.5ml冰乙酸，28.5ml水。TAE(50×)：242g Tris堿，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5 M EDT

25、A (pH8.0)，用時(shí)稀釋50倍。加樣緩沖液(6×)：0.25%溴酚藍(lán)，40%(w/v)蔗糖水溶液。溴化乙錠（或其無(wú)毒替代品）：10mg/ml。 RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100加熱15分鐘,使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf管分裝成小份保存于-20。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。五、常見(jiàn)問(wèn)題1. 加入solution.III，經(jīng)

26、10分鐘離心后細(xì)菌沉淀怎么不結(jié)實(shí)，有的漂浮在液面，有的貼在離心管壁上，一搖晃即破碎脫落下來(lái)？ 細(xì)菌的用量太少，導(dǎo)致產(chǎn)生的沉淀主要是鹽分的沉淀，因?yàn)槿鄙僮冃缘募?xì)菌蛋白和細(xì)菌基因組DNA 的纏繞，沉淀就顯得不結(jié)實(shí)。解決方法：將細(xì)菌的用量增加。2.加入soln.III，經(jīng)10分鐘離心后細(xì)菌沉淀怎么不結(jié)實(shí)，呈大塊的水泡狀，上清較少？ （1）使用了過(guò)多的細(xì)菌，導(dǎo)致菌體未被有效裂解。解決方法：將細(xì)菌用量減半。 （2）細(xì)菌懸浮不充分,存留小菌塊, 導(dǎo)致菌體未被有效裂解。解決方法：注意將細(xì)菌懸浮充分。 （3）加Solution III后中和不充分。解決方法：如果細(xì)菌用量較多，請(qǐng)注意多翻轉(zhuǎn)幾次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花狀(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花狀)。 （4）Solution II出現(xiàn)沉淀。解決方法：如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度低于15，使用試劑盒前請(qǐng)注意觀(guān)察Solution II中是否出現(xiàn)沉淀。如果出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)于37水浴溶解沉淀后再使用。 （5）Solution II 長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中被CO2中和，導(dǎo)致菌體未能被有效裂解。解決方法：可用