PCNA反義寡脫氧核苷酸對BIU-87細胞體外增殖活性的影響

1、    PCNA反義寡脫氧核苷酸對BIU-87細胞體外增殖活性的影響        【摘要】目的為探討基因治療膀胱癌的新途徑，使用增殖細胞核抗原(PCNA)反義寡聚核苷酸(ASODN)作用于膀胱癌細胞系BIU-87。方法應(yīng)用細胞生長曲線和MTT比色法檢測細胞增殖活性，并采用免疫組織化學方法(SABC法)檢測PCNA蛋白的表達。結(jié)果ASOND (30 m)處理組細胞與對照組比較生長曲線差異有顯著性，增殖顯著受抑(P0.05)，PCNA蛋白表達完全抑制。而SODN組則無此作用(P

2、0.05)。結(jié)論PCNA反義寡聚核苷酸可以顯著抑制BIU-87細胞體外增殖活性，其抑制作用可能通過阻斷PCNA蛋白表達實現(xiàn)。【關(guān)鍵詞】膀胱腫瘤增殖細胞核抗原反義寡核苷酸 Effect of antisense oligodeoxynucleotide targeting the mRNA of proliferating cell nuclear antigen on the proliferation of bladder cancer cell line BIU-87WANG Tongguang, ZENG Fuqing, ZHU Zhaohui, et al.Department of

3、Urology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030【Abstract】ObjectiveIn order to search for a new gene therapy for bladder cancer. MethodThe human bladder cancer cell line BIU-87 was treated with antisense oligodeoxynucleotides targeting the mRNA encoding proliferating cell nuclear ant

4、igen (PCNA). The inhibition of proliferation was studied by cell growth curves and MTT method. The expression of PCNA was detected immunohistochemically. ResultThe cell proliferation was inhibited effectively by antisense oligodeoxynucleotides (P0.05). The protein expression of PCNA was inhibited co

5、mpletely by 24 h. The sense oligodeoxynucleotides showed no such effect (P0.05). ConclusionAntisense oligonucleotides can obviously inhibit the proliferation of bladder cancer cell by inhibiting the expression of PCNA.【Key words】Bladder cancerProliferating cell nuclear antigenAntisense oligodeoxynuc

6、leotides我們使用增殖細胞核抗原(PCNA)反義寡脫氧核苷酸導入人膀胱癌BIU-87細胞，研究其對BIU-87細胞體外增殖的影響，現(xiàn)報道如下。材料與方法1. 細胞培養(yǎng)和寡脫氧核苷酸處理人膀胱移行細胞癌細胞株BIU-87由北京醫(yī)科大學泌尿外科研究所建系并提供，于含體積分數(shù)為10%胎牛血清(FCS)RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)，37，體積分數(shù)為5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶(trypsine, BIB分裝，華美公司)消化傳代。我們采用與PCNA mRNA AUG端互補的反義寡脫氧核苷酸及正義寡脫氧核苷酸，序列如下：ASO-DN：5GAC CAG GCG

7、 CGC CTC GAA3，SODN：5TTC GAG GCG CGC COT GGT C3。由上海生工公司合成，全硫代修飾，純化后凍干粉保存。使用前加入去離子水溶解，并于95水浴變性5分鐘，冰上驟冷兩分鐘后加入無血清不含抗生素培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度備用。2. 細胞生長曲線測定當細胞長至80%匯合時，使用trypsine消化貼壁細胞，重懸于培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度至1×104/ml種植入96孔培養(yǎng)板，每孔100 l。分為3組，每組3孔，分別加入30 mol/L濃度ASODN及SODN和正常培養(yǎng)基對照，37，體積分數(shù)為5% CO2溫箱培養(yǎng)，此時點定為0點。4小時后加入含20% FCS培養(yǎng)基1

8、00 l。每24小時于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)，參考鄂征的方法繪制細胞生長曲線。3. MTT法檢測細胞增殖活性同上法分別用ASODN，SODN及正常培養(yǎng)基處理細胞，24小時后每孔吸出上清100 l,分別加入5 g/L MTT(Sigma公司)20 l,繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，每孔吸棄上清100 l,并加入二甲亞砜150 l,振搖溶解形成的甲月贊顆粒，立即于酶標儀下570 nm波長測OD值。同時以下列公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=(空白對照組OD值-處理組細胞OD值)/空白對照組OD值×100%。4. 免疫組化法檢測PCNA蛋白表達采用SABC法。單克隆抗體PC10及SABC

9、試劑盒購自Sigma公司及武漢博士德生物工程公司。細胞以2×107/ml濃度種于預置小蓋片的24孔細胞培養(yǎng)板中，按上述方法處理細胞后24小時取出蓋片，1%多聚甲醛固定5分鐘后PBS洗3次，每次3分鐘。1% Triton X-100 TBS液4處理18小時后正常山羊血清封閉，依次加入PC 10，生物素化山羊抗小鼠IgG及SABC各37，30分鐘。每步后均以PBS振洗3×3分鐘，并防止蓋片干燥。然后DAB發(fā)色，鏡下控制時間，流水中止反應(yīng)，蘇木素復染核，脫水，封片。以PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判定：陰性對照無顯色，陽性細胞胞核呈棕褐色，邊界清晰，胞漿無顯色。計算PI值：PI=

10、(每500個細胞中陽性細胞數(shù)/500)×100%5. 數(shù)據(jù)分析采用t檢驗、2檢驗。結(jié)果1. 細胞形態(tài)觀察光鏡下以上皮樣細胞為主，多呈三角形、紡錘形，少數(shù)呈多角形。細胞核異形性明顯，核仁清楚，13個不等，胞漿豐富，可見多個顆粒及空泡。ASOND處理組見部分細胞胞體變小，固縮呈圓形，胞核及胞漿輪廓折射增強，較粗糙，分裂相少見，較對照組明顯稀疏。2. 細胞生長曲線SODN組與對照組相比差異無顯著性，ASODN組與對照及SODN組相比細胞生長顯著受抑(P0.05)，至第5天方開始出現(xiàn)明顯增殖。3. MTT法比色結(jié)果見表1。表1MTT比色法比較細胞增殖活性(<"x- (878

11、bytes)" src="/med/cano/201003/20100322160438350" 11 15>±s)濃度(mol/L)A570nmSODNASODN00.52±0.010.52±0.01100.49±0.030.47±0.05300.50±0.040.43±0.01*600.52±0.010.37±0.02*     注：*組間比較P0.01；同組內(nèi)比較P0.05 4. 免疫組化法測定蛋白質(zhì)表達陰性對照組無核顯色。

12、空白對照組PI及SODN組PI分別為(?48.4±0.2)%和（43.9±4.6）%，二者相比差異無顯著性(P0.05)。ASODN組無明顯核著色，蛋白表達明顯受抑。討論近年來研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中存在著p53突變，Rb基因及WAF等抑癌基因表達減少及c-myc,EGFR，c-erbB-2等癌基因的過表達等多種基因表達失衡1。這種失衡的最終結(jié)果是導致了細胞增殖活性的增加。PCNA作為DNA合成酶的輔基，為細胞增殖所必需，在G1晚期開始增加，S期達到高峰，G2和M期明顯下降，而在靜止期細胞含量很少，在多種惡性腫瘤中，PCNA表達增加，且與腫瘤惡性度、預后有密切相關(guān)。反義核酸技術(shù)是

13、以堿基互補配對的原理，合成一般與相應(yīng)基因mRNA序列互補的寡核苷酸，使之與相應(yīng)mRNA結(jié)合，通過阻斷翻譯，抑制轉(zhuǎn)錄后加工或激活RNaseH特異性降解mRNA-DNA雙鏈中mRNA鏈而起到阻止相應(yīng)基因表達的作用2。我們利用針對PCNA mRNA的全硫代修飾的ASODN研究其對膀胱癌細胞體外增殖的影響。因為硫代修飾可以提高寡聚核苷酸對血清及胞內(nèi)核酸酶降解的抗性，延長其作用效果。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASODN可完全抑制PCNA蛋白的表達，并顯著抑制BIU-87細胞的增殖，且其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。我們在實驗過程中并且觀察到ASODN處理過的BIU-87細胞的細胞接種率明顯小于空白對照組及SODN處理組細胞。但當我們試進一步研究細胞軟瓊脂培養(yǎng)克隆形成率時未獲成功。細胞接種后貼壁是某些體外培養(yǎng)貼壁細胞增殖的必要條件，與惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移也有一定關(guān)系。PCNA反義寡核苷酸對BIU-87細胞接種率的影響可能有助于防止膀胱癌細胞的轉(zhuǎn)移。本課題為國家自然科學基金、衛(wèi)生部吳階平科研基金資助項目作者單位：430022武漢，同濟醫(yī)科大學協(xié)和醫(yī)院泌尿外科參考文獻1邵