反義單核細(xì)胞趨化蛋白-1轉(zhuǎn)基因表達(dá)對單核細(xì)胞在動脈內(nèi)膜粘附的影響

1、    反義單核細(xì)胞趨化蛋白-1轉(zhuǎn)基因表達(dá)對單核細(xì)胞在動脈內(nèi)膜粘附的影響        【摘要】目的了解動脈粥樣硬化發(fā)病過程中單核細(xì)胞粘附并進(jìn)入動脈內(nèi)膜的機(jī)制，分析單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）基因表達(dá)對單核細(xì)胞粘附動脈內(nèi)膜的作用。方法以實(shí)驗(yàn)性高脂血及輕度氧化LDL（MM-LDL）局部保留灌注的家兔股動脈為模型，采用DOTAP陽離子脂質(zhì)體包裹LNCX-anti-MCP-1質(zhì)粒，將反義MCP-1 cDNA定位導(dǎo)入家兔股動脈鞘及周圍組織，以原位雜交、 Northern雜交及狹

2、縫雜交法觀察反義MCP-1基因的表達(dá)，應(yīng)用掃描電鏡觀察單核細(xì)胞在動脈內(nèi)膜粘附的情況。結(jié)果PCR檢測發(fā)現(xiàn)重組基因的整合，RNA水平的檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組有反義MCP-1 mRNA的表達(dá)，且實(shí)驗(yàn)組正義MCP-1 mRNA的表達(dá)量比對照組減少，對照組可見明顯的單核細(xì)胞粘附，實(shí)驗(yàn)組則未見此現(xiàn)象。結(jié)論用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體-陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的反義MCP-1轉(zhuǎn)基因表達(dá)能減少靶基因表達(dá)并抑制單核細(xì)胞在動脈內(nèi)膜粘附，為動脈粥樣硬化防治提供了一個新的研究線索?！娟P(guān)鍵詞】單核細(xì)胞；單核細(xì)胞化學(xué)吸引蛋白質(zhì)1；RNA，反義；內(nèi)皮，血管 Inhibition of monocytes adhesion to the intim

3、a of arterial wall by local expression of antisense monocyte chemotactic protein-1WU Qiang, QIAO Huihong, WANG Zongli, ZHANG Hua,LIU Peimao, XU Man, REN Guofeng, ZHAO Sanmei, SHE Mingpeng(Institute of Basic Medical Science, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijin

4、g 100005, China)【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of monocyte recruitment in atherogenesis and to clarify the effect of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in this process. MethodsFemoral arteries isolated from the rabbits which had been fed with a high cholesterol diet and locally perfus

5、ed with MM-LDL within the artery beforehand, were used as the models. Antisense MCP-1cDNA was transferred into the arterial wall by injecting recombinant LNCX-anti-MCP-1/liposomal complex in the femoral sheath and the periarterial tissue. ResultsExpression of antisense MCP-1 mediated by recombinant

6、LNCX plasmid/lipsomal complex gene transfer enabled to inhibit MCP-1 gene expression and adhesion of monocyte to the intima. ConclusionMCP-1 plays an important role on the recruitment of monocytes in the arterial wall, which provides a potential clue in developing a gene therapy project for the prev

7、ention and treatment of atherogenesis.【Key words】Monocytes;Monocyte chemoattractant protein-1;RNA,antisense;Endothelium,vascular單核細(xì)胞粘附進(jìn)入內(nèi)皮下間隙，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞是動脈粥樣硬化早期的病理表現(xiàn)。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）是一個作用極強(qiáng)的單核細(xì)胞趨化因子，不僅具有吸引單核細(xì)胞移動的功能，而且對血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的表達(dá)亦具有調(diào)節(jié)作用1-3，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，但目前

8、對其在體內(nèi)的作用及機(jī)制尚未完全了解。我們將反義MCP-1 cDNA重組表達(dá)質(zhì)粒定位導(dǎo)入家兔股動脈鞘及動脈周圍組織，觀察反義MCP-1基因表達(dá)對MCP-1 mRNA表達(dá)的抑制作用，及其對單核細(xì)胞粘附進(jìn)入動脈內(nèi)膜的影響。材料和方法1質(zhì)粒、菌株、引物：含有MCP-1 cDNA的pBluescript質(zhì)粒由美國國家腫瘤研究所Yoshimura博士惠贈。逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體LNCX-anti-MCP-1質(zhì)粒由本室構(gòu)建4。PCR引物：P1 5-CGTGTGTTCTTGGGT-TGTGG-3；P2 5-CAGGTGGGGTCTTTCATTCC-3由美國Cybersyn生物工程公司協(xié)助設(shè)計并合成。2試劑和探針：

9、二油酰氧丙基-三甲基氨硫酸鹽(DOTAP)陽離子脂質(zhì)體購自Boehringer Mannheim公司，總RNA、DNA提取試劑盒購自Promega公司。32P標(biāo)記正義及反義RNA探針用pBluescript-Sk/MCP-1cDNA質(zhì)粒,按Promega公司RNA探針體外合成系統(tǒng)藥盒操作手冊合成。3DOTAP脂質(zhì)體/DNA的制備：溶液A：羥乙基派嗪- 乙基磺酸緩沖液(HBS:20 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, pH 7.4)稀釋LNCX-anti-MCP-1超螺旋質(zhì)粒DNA至終濃度30 g/ml，溶液B：羥乙基派嗪- 乙基磺酸緩沖液稀釋DOTAP至終濃度80 g

10、/ml, 輕輕將兩種溶液混合，室溫放置15 min。4輕度氧化低密度脂蛋白（MM-LDL）的制備：密度梯度超速離心法提取低密度脂蛋白，按文獻(xiàn)5方法用含F(xiàn)e2SO4的PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）攪拌透析60 h制備并鑒定。5動物：新西蘭大耳白兔，雄性，體重2.5 kg, 購自衛(wèi)生部生物制品檢定所。6慢性動物實(shí)驗(yàn)：取8只血清總膽固醇處于0.91 mmol/L的新西蘭大耳白兔，任選2只做為實(shí)驗(yàn)組，用25%烏拉坦麻醉(1 g/kg體重)后，按Rios等6的方法手術(shù)分離暴露兩側(cè)股動脈鞘，在鞘內(nèi)注射DOTAP包裹的LNCX-anti-MCP-1質(zhì)粒300 l（含DNA 10 g），鄰近股動脈

11、周圍組織中注射生理鹽水稀釋的上述質(zhì)粒500 l（含DNA 100 g），對照組注射等分子量的LNCX載體質(zhì)粒,縫合傷口，以1.01.5 g.kg-1.d-1給動物喂食膽固醇20 d后，當(dāng)每只兔的血膽固醇濃度達(dá)26 mmol/L左右取材，檢測局部股動脈及周圍組織中重組基因的整合、表達(dá)，掃描電鏡觀察股動脈內(nèi)膜單核細(xì)胞的粘附。7急性動物實(shí)驗(yàn)：術(shù)前3 d每只兔的左腹股溝處局部肌注丁哌卡因9 mg。實(shí)驗(yàn)兔麻醉后手術(shù)分離暴露約4 cm長一段股動脈，結(jié)扎其分支，用動脈夾夾住兩端。用注射器以肝素生理鹽水沖洗后,灌注 MM-LDL(600 mg/ml)至股動脈完全被MM-LDL充盈后，阻斷遠(yuǎn)側(cè)端，保留灌注 2

12、h后恢復(fù)血流，在右側(cè)股動脈鞘內(nèi)注射DOTAP包裹的LNCX-anti-MCP-1質(zhì)粒DNA，周圍肌肉注射生理鹽水稀釋的質(zhì)粒DNA，用量與慢性實(shí)驗(yàn)相同6。術(shù)后2 d取材,檢測局部股動脈中重組基因的整合表達(dá),觀察動脈內(nèi)膜單核細(xì)胞的粘附7。8原位雜交：冷凍切片經(jīng)RNase、蛋白酶K處理，經(jīng)預(yù)雜交后，加入-32P-CTP 標(biāo)記的正義MCP-1 RNA探針，其放射活性為5×104 min/m，濕盒中保溫，沖洗切片后涂布11稀釋的核4乳膠（中國科學(xué)院高能原子研究所），置密閉暗盒中-20 曝光3 d，顯影定影后HE染色7。9狹縫雜交及Northern雜交：參照文獻(xiàn)8進(jìn)行，提取的總RNA經(jīng)電泳和紫外

13、分光光度法檢測純度，嚴(yán)格定量每份樣品上樣量為25 g。狹縫雜交為比較實(shí)驗(yàn)組與對照組正義MCP-1 mRNA表達(dá)量的差別，以反義MCP-1 mRNA為探針與提取的組織總RNA雜交，放射自顯影后成像，經(jīng)UVI像分析儀掃描，比較每組條帶掃描所得吸光度值（A）的平均數(shù)。10掃描電鏡標(biāo)本制備：將股動脈縱行剖開，鋪平、沖洗后用2.5%戊二醛4下固定2 h，PBS漂洗，1%鋨酸后固定2 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，醋酸異戊酯浸泡過夜后，浸入六-甲基-二硅胺烷3 min，噴金。掃描電鏡觀察血管內(nèi)膜表面。結(jié)果1重組基因轉(zhuǎn)染后LNCX-anti-MCP-1在股動脈整合情況的檢測：用與載體序列互補(bǔ)的P1和與MCP-1序列互

14、補(bǔ)的P2為引物，以提取的股動脈組織基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組皆擴(kuò)增出特異片段(415 bp)，對照組則未見此片段。2重組基因轉(zhuǎn)基因后反義MCP-1 mRNA在股動脈表達(dá)情況的檢測：（1）原位雜交：用正義MCP-1 mRNA探針進(jìn)行組織切片原位雜交，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組動物經(jīng)重組基因轉(zhuǎn)基因后股動脈壁內(nèi)側(cè)肌層平滑肌細(xì)胞有反義MCP-1 mRNA 的表達(dá)(1)。（2）Northern 雜交： 實(shí)驗(yàn)組皆檢測到了反義MCP-1mRNA的表達(dá)，對照組則未測到反義MCP-1 mRNA的表達(dá)(2)。（3）狹縫雜交：急慢性實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組MCP-1 mRNA的表達(dá)都有所減少，其中慢性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組

15、股動脈中MCP-1 mRNA的表達(dá)量都比對照組少（3）。以GAPDH cDNA為探針與提取的mRNA進(jìn)行狹縫雜交，結(jié)果表明反義重組基因轉(zhuǎn)染不影響GAPDH的表達(dá)。1實(shí)驗(yàn)組動物經(jīng)重組基因轉(zhuǎn)染后股動脈平滑肌細(xì)胞有反義MCP-1表達(dá)原位雜交×1 0001、4：慢性實(shí)驗(yàn)重組基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；2、3：急慢性實(shí)驗(yàn)對照組；57：急性實(shí)驗(yàn)重組基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組2用正義MCP-1 RNA探針進(jìn)行Northem雜交分析重組基因轉(zhuǎn)染后反義MCP-1 mRNA的結(jié)果1：急性實(shí)驗(yàn)對照組；2：急性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組；3：慢性實(shí)驗(yàn)對照組；4：慢性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組3反義RNA探針進(jìn)行狹縫雜交分析實(shí)驗(yàn)動物股動脈MCP-1 mRNA表達(dá)結(jié)果

16、3單核細(xì)胞對血管內(nèi)皮的粘附情況：用掃描電鏡觀察可見急性及慢性實(shí)驗(yàn)對照組的股動脈內(nèi)膜表面皆有明顯的單核細(xì)胞粘附，平均每個高倍視野（×1 000）中可見35個成堆或散在的單核細(xì)胞粘附，但轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)組各動脈的股動脈內(nèi)膜未見單核細(xì)胞粘附（47）。4急性實(shí)驗(yàn)重組基因轉(zhuǎn)染組家兔股動脈內(nèi)膜，經(jīng)MM-LDL刺激后，在多數(shù)連續(xù)觀察的視野中沒有單核細(xì)胞粘附×1 5005急性實(shí)驗(yàn)對照組股動脈內(nèi)膜經(jīng)MM-LDL刺激作用后有成堆的單核細(xì)胞粘附×3 0006慢性實(shí)驗(yàn)對照組家兔股動脈內(nèi)膜，在慢性實(shí)驗(yàn)性高脂血情況下，可見散在的單核細(xì)胞粘附在動脈內(nèi)膜×1 300(左側(cè)為同一細(xì)胞的高倍放大

17、×10 000)7慢性實(shí)驗(yàn)重組基因轉(zhuǎn)染組股動脈內(nèi)膜，在慢性實(shí)驗(yàn)性高脂血情況下，未見單核細(xì)胞粘附×1 190討論單核-巨噬細(xì)胞首先進(jìn)入動脈內(nèi)膜并在內(nèi)皮下形成泡沫細(xì)胞是動脈粥樣硬化最早期的病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，繼之則發(fā)生中膜平滑肌細(xì)胞（SMC）向內(nèi)膜的移動和增生。同時大量的研究（包括人體和動物實(shí)驗(yàn)材料）表明，在冠狀動脈成形術(shù)后動脈再狹窄，搭橋手術(shù)后血管的再狹窄和在移植心臟冠狀動脈中發(fā)生的以大量單核細(xì)胞浸潤為特征的快發(fā)性冠狀動脈閉塞的過程中均首先發(fā)生單核細(xì)胞的浸潤（伴有手術(shù)創(chuàng)面的血小板粘附或血栓形成）。單核細(xì)胞作為人體的清道夫細(xì)胞，在動脈內(nèi)膜受損部位通過清除有害因子（如過氧化脂質(zhì)及其他

18、致病物質(zhì)）等對機(jī)體具有重要的保護(hù)作用，但單核-巨噬細(xì)胞是一種多功能的分泌和免疫活性細(xì)胞，巨噬細(xì)胞在進(jìn)行吞噬等功能活動時可釋放一系列細(xì)胞因子和其他各種活性物質(zhì)。如：血小板源生長因子（PDGF），干擾素（INF），轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-），白細(xì)胞介素（IL）-1等9，10。體外實(shí)驗(yàn)證明這些因子除可促進(jìn)SMC增生和吞噬脂質(zhì)外，可刺激或誘導(dǎo)血管壁其他細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、SMC）相關(guān)基因的表達(dá)，形成細(xì)胞因子瀑布反應(yīng)，而進(jìn)一步加劇內(nèi)膜損傷、SMC移動增生等10，11。因此，防止巨噬細(xì)胞進(jìn)入動脈，抑制細(xì)胞因子瀑布反應(yīng)將對動脈粥樣硬化的防治具有重要意義。Schwartz等12證明MCP-1為作用很強(qiáng)的單核細(xì)胞趨

19、化因子，且有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)相關(guān)粘附分子的作用,顯示其具有調(diào)節(jié)單核細(xì)胞粘附及進(jìn)入動脈壁的雙重功能，在單核細(xì)胞粘附進(jìn)入動脈內(nèi)膜過程中具有十分重要的作用。雖然近年的大量研究發(fā)現(xiàn)許多物質(zhì)，如：IL-8、PDGF、IL-1、凝血酶、TXA2等均與單核細(xì)胞進(jìn)入動脈內(nèi)膜有關(guān)，但其中MCP-1被認(rèn)為是最重要的，Navab等13用單克隆抗體進(jìn)行的阻斷實(shí)驗(yàn)表明，在血管壁細(xì)胞分泌的單核細(xì)胞趨化物質(zhì)中MCP-1起最重要的作用。目前已設(shè)計出許多將基因定位導(dǎo)入特定節(jié)段的血管壁的有效方法14，我們按照Rios等6的方法用脂質(zhì)體包裹重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法將反義MCP-1基因?qū)胪霉蓜用}鞘及周圍組織，觀察到重組反義基因可在

20、動脈壁表達(dá)反義MCP-1，并對動脈壁自身的MCP-1 mRNA及單核細(xì)胞在動脈內(nèi)膜上的粘附有抑制作用。表明用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體-陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的反義MCP-1重組基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能阻斷或減少靶基因表達(dá)并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng),為動脈粥樣硬化防治中可能應(yīng)用的基因治療方案提供了新的線索。（本文編輯：常秀青）基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(39570287)通信作者：王宗立作者單位：吳強(qiáng)（100005 北京，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)研究室）喬繪（100005 北京，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)研究室）紅王宗立（100005 北京，中國協(xié)和醫(yī)科大

21、學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)研究室）張華（100005 北京，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)研究室）劉佩毛（100005 北京，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)研究室）許漫（100005 北京，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)研究室）任國鋒（100005 北京，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)研究室）趙三妹（100005 北京，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)研究室）佘銘鵬（100005 北京，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)研究室）參考文獻(xiàn)1，Valente A

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