人源抗HER2單鏈抗體輕鏈恒定區(qū)魚精蛋白截短體融合蛋白的基因構(gòu)建、表達及活性鑒定(1)

1、人源抗HER2單鏈抗體/輕鏈恒定區(qū)/魚精蛋白截短體融合蛋白的基因構(gòu)建、表達及活性鑒定(1)                                   作者：王凱，溫偉紅，王濤，張瑞，秦煒煒，雷小英，楊安鋼 【關(guān)鍵詞】  HER2；,單鏈抗體

2、；,魚精蛋白Construction and expression of human antiHER2 ScFv/Ck/tP fusion protein in E.coli and identification of its activity【Abstract】  AIM: To construct a fusion protein gene of human antiHER2 ScFv/light chain constant region/truncated protamine (ScFv/Ck/tP) and analyze the binding activity of t

3、he expressed protein. METHODS: Two pairs of oligonucleotide primers were designed and used to amplify the ScFv and the Ck gene. After they were linked as ScFv/Ck, the synthesized tP coding sequence was added in the 3 terminus of it, then the fusion protein gene ScFv/Ck/tP was cloned into expression

4、vector pET32a and expressed in E. coli BL21 (DE3). Expressed protein was detected by SDSPAGE and Western Blot and purified by NiNTA chelating agarose. The antigenbinding activity of the ScFv/Ck/tP fusion protein was confirmed by cellular ELISA, and the DNA binding ability was confirmed by gel shift

5、assay. RESULTS: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing proved that ScFv/Ck/tP was correctly cloned into expression vector. SDSPAGE and Western Blot analysis showed that ScFv/Ck/tP fusion protein was successfully expressed in E. coli BL21. Cellular ELISA confirmed that it had specific

6、antigen binding activity;  gel shift assay assured that it had DNA binding ability. CONCLUSION: The ScFv/Ck/tP fusion protein expressed in E. coli could specially bind with both HER2 antigen and DNA.【Keywords】 HER2; single chain antibody; protamine【摘要】  目的：構(gòu)建人抗HER2單鏈抗體(ScFv)/人輕鏈恒定區(qū)（Ck）/魚精蛋

7、白截短體(tP)融合蛋白基因，在大腸桿菌中表達、純化并分析該融合蛋白的活性. 方法：設計引物擴增人抗HER2單鏈抗體e23sFv基因和輕鏈恒定區(qū)編碼序列(Ck)，連接成ScFv/Ck片段，人工合成tP序列，連接于ScFv/Ck末端，構(gòu)建成ScFv/Ck/tP融合基因，將其克隆入原核表達載體pET32a后，在大腸桿菌BL21(DE3)LysS中誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE和Western Blot鑒定后，用NiNTA螯合層析介質(zhì)純化. 細胞ELISA分析ScFv/Ck/tP融合蛋白抗原親合活性，凝膠遷移實驗檢測ScFv/Ck/tP融合蛋白與DNA的結(jié)合活性. 結(jié)果：成功構(gòu)建了人抗HER2

8、ScFv/Ck/tP融合基因，經(jīng)IPTG誘導后在大腸桿菌中實現(xiàn)了可溶性表達. 表達的ScFv/Ck/tP融合蛋白保持了與抗原的結(jié)合活性，同時具有結(jié)合DNA的能力. 結(jié)論：ScFv與Ck，tP融合后，同時具有抗原和DNA結(jié)合活性，為該ScFv用于HER2陽性腫瘤的靶向基因治療奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】 HER2；單鏈抗體；魚精蛋白0引言HER2是癌基因erbB2/neu的表達產(chǎn)物，在乳腺癌、卵巢癌等多種人類腫瘤細胞中高度表達，是目前公認的腫瘤細胞表面的特異性標志分子1-2. 單鏈抗體(single chain variable fragment，ScFv)和親代抗體相比，具有分子小、穿透力強、免疫原

9、性低的特點，日益成為診斷和治療的良好導向載體 3-4. 魚精蛋白是一種堿性蛋白，能與核酸結(jié)合5. 魚精蛋白截短體(truncated protamine，tP)是一段長22個氨基酸的短肽，它保留了富含堿性氨基酸的序列，同樣具有核酸結(jié)合功能. 我們將抗HER2 ScFv基因和tP編碼序列融合，同時為了避免ScFv和tP之間空間結(jié)構(gòu)的相互影響，在其間插入了一段輕鏈恒定區(qū)編碼序列（kappa light chain constant region, Ck），以期獲得同時具有抗原和核酸結(jié)合活性的ScFv/Ck/tP融合蛋白，核酸與該融合蛋白結(jié)合后，在其引導下，有望實現(xiàn)核酸的靶向輸送，旨在為該ScFv在

10、HER2陽性腫瘤的靶向基因治療的應用中奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料質(zhì)粒pCMVe23sFvPEIIGrBa6，pComb3HFab15，pUC19，pET32a；大腸桿菌DH5，BL21(DE3)LysS和HER2陽性的人胃癌細胞系SGC7901（第四軍醫(yī)大學生物化學與分子生物學教研室）；限制性內(nèi)切酶、連接酶（日本TaKaRa公司）；IPTG（美國Promega公司）；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒（合肥優(yōu)晶生物技術(shù)有限公司）；HiTrap NiNTA螯合層析介質(zhì)(美國Invitrogen公司)；6 His mAb（德國Qiagen公司）；HRP羊抗鼠IgG（武漢博士德生物有限公司）；E

11、CL化學發(fā)光試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；標準胎牛血清（中國醫(yī)學科學院生物工程研究所）.1.2方法1.2.1引物和tP編碼序列寡核苷酸的設計與合成設計擴增ScFv基因的引物 S5： 5tttgaattcgacgtccagctgacccagtct3，S3：5tttctcgagggagacggtgaccgtggtccc3，在兩端引物中分別引入EcoR I和Xho I酶切位點（下劃線部分）. 擴增Ck序列的引物  Ck5： 5tttctcgagactgtggctgcaccatctgt3，Ck3：5ttttctagact

12、aacactctcccctgttga3，在兩端引物中分別引入Xho I和Xba I酶切位點（下劃線部分）.  tP編碼序列寡核苷酸合成 tP1：5ctagacgcagccagagccggagcagatattaccgccagagacaaagaagtcgcagacgaaggaggcggagcgc 3，tP2：5tgcgtcggtctcggcctcgtctataatggcggtctctgtttcttcagcgtctgcttcctccgcctcgcgccgg3，寡核苷酸鏈的兩端帶有Xba I和Not I酶切位點的粘端序列（下劃線部分），能夠直接與經(jīng)Xba I和Not I酶切的載體連接. 引物

13、和寡核苷酸由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成.1.2.2ScFv/Ck/tP融合基因重組表達載體的構(gòu)建及鑒定分別以pCMVe23sFvPEIIGrBa和pComb3HFab15質(zhì)粒為模板， S5，S3和Ck5，Ck3為引物PCR擴增ScFv和Ck片段，產(chǎn)物經(jīng)相應的酶切后，一起克隆入pUC19質(zhì)粒，并進行序列測定，測序正確后的質(zhì)粒命名為pUC19ScFv/Ck. 將合成的兩條tP編碼序列寡核苷酸鏈緩慢退火后，與從pUC19ScFv/Ck質(zhì)粒用EcoR I和Xba I切下的ScFv/Ck片段一起連接入經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切的pET32a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5后，篩選陽性克隆，酶切鑒定，對酶

14、切鑒定正確的克隆交由北京奧科生物技術(shù)有限公司測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pET32aScFv/Ck/tP.1.2.3ScFv/Ck/tP融合基因的誘導表達及鑒定將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET32aScFv/Ck/tP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單克隆，接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 過夜培養(yǎng)，次日以1100接種，37 培養(yǎng)至A600 nm達0.6左右，加入IPTG終濃度為0.5 mmol/L，誘導培養(yǎng)3 h，取5 mL未誘導及誘導菌液離心收集菌體，以100 mmol/L TrisHCl (pH 8.0)重懸，超聲裂菌后離心，取少量上清加入等量2×SDS上樣緩沖液，沉淀重懸于適量1

15、×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min,離心后取上清進行SDSPAGE分析，凝膠薄層掃描分析蛋白表達情況. 同時對表達產(chǎn)物進行Western Blot鑒定，蛋白樣品經(jīng)SDSPAGE分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，依次加入鼠抗6 His mAb（11000稀釋，4 孵育過夜），HRP標記的山羊抗小鼠IgG(15000稀釋，室溫1 h)，用化學發(fā)光試劑盒于暗室條件下X光片感光顯影.1.2.4表達產(chǎn)物的分離純化取200 mL誘導菌離心后收集菌體，用100 mmol/L TrisHCl (pH 8.0)重懸，冰浴中溫和超聲6次（每次2 min，間隔10 s）破碎菌

16、體，4 ，10 000 g離心5 min，收集上清過0.45 m濾膜，用鎳次氨基三乙酸(Ni2+NTA)螯合層析介質(zhì)室溫結(jié)合1 h，用洗滌緩沖液（100 mmol/L TrisHCl，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗滌5次后，分別用含100，200，500 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液洗脫. 各取少量不同組洗脫液加入等量2×SDS Loading Buffer，煮沸5 min,離心后取上清進行SDSPAGE分析.1.2.5表達產(chǎn)物的抗原結(jié)合活性檢測采用細胞ELISA的方法. 胰酶消化生長鋪滿的SGC7901細胞，重懸于含100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，

17、調(diào)整細胞密度為5×108/L ，以100 L/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板，37，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h， 細胞充分貼壁生長. 40 g/L 多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次. 每孔加入100 L含30 mL/L H2O2 PBS，室溫反應20 min，PBS洗3次. 在細胞包被孔中分別加入不同稀釋度的蛋白樣品，每孔100 L，設復孔，陰性對照，37孵育1 h，依次加入鼠抗6 His mAb(11000稀釋)，HRP標記的山羊抗小鼠IgG（15000稀釋）孵育，TMB顯色，終止反應后測定各孔A450 nm值. 1     &

18、#160;（version 9.00）.Variance analysis of the 2×2 factoral design was conducted for: ages; height; weight; anesthetic effect ratings; the period from anesthesia to operation, and Apgar scores of 1 minute after the fetus was taken out; SBP, DBP, HR, and SBP×HR prior to and after anesthesia. t Test was conducted for intra-group comparison. 0.05.     1.8  Medical Ethics   It met