抗人β淀粉樣肽特異性單鏈抗體的噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建與初步鑒定(1)

1、抗人淀粉樣肽特異性單鏈抗體的噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建與初步鑒定(1) 作者：段朝暉，毛越蘋，羅曉紅，李民友，勞偉思，王英，朱振宇 【摘要】 目的： 運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建抗人淀粉樣肽（A）特異性單鏈抗體的抗體庫(kù)并進(jìn)行初步鑒定. 方法： 從A免疫的BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞中提取總RNA，分離純化mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成其總cDNA. 以PCR方法分別擴(kuò)增出抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因片段，再經(jīng)重組PCR將兩基因片段由編碼十五肽(Gly4Ser)3的接頭連在一起，克隆到噬菌粒載體pCANTAB 5E中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1，經(jīng)輔助噬菌體M13KO7超感染后回收全部重組噬菌體，構(gòu)建噬菌體抗體

2、庫(kù)，SDSPAGE 鑒定純度. 結(jié)果： 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，RTPCR方法擴(kuò)增的抗體VH和VL基因片段大小約350 bp和325 bp，與預(yù)期VH，VL基因片段理論值相符. 經(jīng)重組PCR得到大小約750 bp的ScFv基因片段. ScFv基因片段經(jīng)雙酶切后成功定向克隆到噬菌粒載體，回收后構(gòu)建成庫(kù)容量為1.1108的噬菌體抗體庫(kù)，經(jīng)SDSPAGE 鑒定，得到Mr約為30000 ku，純度較好的ScFv抗體. 結(jié)論： 成功構(gòu)建了庫(kù)容量大的特異性噬菌體抗體庫(kù)，為抗人A特異性抗體的篩選、生物活性鑒定、臨床實(shí)驗(yàn)診斷方法建立和治療應(yīng)用打下基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 噬菌體展示技術(shù)；單鏈抗體；阿爾茨海默病；淀粉樣

3、肽【Abstract】 AIM: To construct and identify the specific antihuman amyloid peptide ScFv by phage antibody library display system. METHODS: Total RNA was extracted from spleen B cells of BALB/c mice immunized with amyloid peptide, and mRNA was purified from the total RNA, then the firststrand cDNA was

4、 synthesized by reverse transcription. Antibody VH and VL gene fragments were amplified by primary PCR and the amplified VH and VL PCR fragments were further joined into a ScFv gene with a 15peptide linker DNA (Gly4Ser)3 with fillin reactions. Then the assembled ScFv gene fragments were amplified an

5、d restriction sites were added by the second PCR. The digested ScFv gene fragments were finally ligated with the phagemids pCANTAB 5E and the phagemids containing ScFv gene were transformed into competent E. coli TG1 cells. The transformed cells were then infected with M13KO7 helper phage to rescue

6、all recombinant phagemids with ScFv gene insert, thus an immune phage ScFv library was constructed. Purity of ScFv was analyzed by SDSPAGE. RESULTS： Antibody VH and VL gene fragments amplified by primary PCR were about 350 bp and 325 bp after analysis by agarose gel electrophoresis and matched the e

7、xpectancy of VH and VL gene fragments. The purified VH and VL PCR fragments were further joined into a ScFv gene with fillin reactions and reached the desired 750 bp expectancy. The recombinant phagemid with ScFv gene insert was rescued, and an immune phage ScFv library with the content of 1.1108 wa

8、s successfully constructed. After analysis by SDSPAGE, a purified ScFv gene was got with a relative molecular weight of about 30000 u. CONCLUSION: An immune phage ScFv library is successfully constructed. The successful preparation of antiA ScFv will serve as a useful tool for studying the etiologic

9、al and pathological mechanism, diagnosis and treatment of patients with Alzheimers disease.【Keywords】 phage display system; single chain variable fragment; Alzheimers disease; amyloid peptide0 引言 阿爾茨海默?。╝lzheimers disease, AD），又稱早老性癡呆癥，是一種以記憶喪失、行為失常、人格改變、思維能力下降和認(rèn)知功能障礙等為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病. 有研究報(bào)道淀粉樣肽（amyl

10、oid peptide, A）與AD的發(fā)病直接相關(guān)1-2. 目前國(guó)內(nèi)僅有制備A42多克隆抗體的相關(guān)工作，有關(guān)建立良好的血液標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究報(bào)道還較少見. 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)3-4構(gòu)建抗A的單鏈抗體庫(kù)，為檢測(cè)血液或腦脊液中A水平并用于診斷AD5-6和抗人A特異性抗體的篩選、生物活性鑒定以及臨床治療應(yīng)用打下基礎(chǔ).1 材料和方法1.1 材料 雌性BALB/c純系小鼠20只，67 wk齡(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；cDNA第一鏈合成回收試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)；鼠ScFv 噬菌體抗體展示系統(tǒng)(瑞典Amersham pharmacia公司)；Trizol試劑(美國(guó)Gibco公司)；

11、DNA多聚酶，QIAquick PCR 純化試劑盒(荷蘭Qiagen公司)；Sfi I內(nèi)切酶，Not I內(nèi)切酶(美國(guó)NEB公司)；T4 DNA Ligase (美國(guó)Invitrogen公司)；A (美國(guó)American peptide公司).1.2 方法1.2.1 動(dòng)物免疫 將0.5 mL的A42(150 mg/L)與等量的完全福氏佐劑混合乳化，直到油包水的狀態(tài)，取5只小鼠用A42進(jìn)行免疫. 第一次基礎(chǔ)免疫：每只小鼠自后足墊注射0.1 mL. 基礎(chǔ)免疫后2 wk再按上述方法用等量的抗原與不完全福氏佐劑乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只小鼠腹腔注射0.1 mL，共加強(qiáng)免疫2次. 45 d后引頸法處死免疫小

12、鼠，取其脾臟.1.2.2 總RNA抽提與mRNA的純化 用TRIzol試劑抽提小鼠脾細(xì)胞的總RNA，并立即純化mRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及純度.1.2.3 cDNA第一鏈的合成 取兩個(gè)滅菌的0.5 mL的離心管，在每一管中依次加入mRNA 2 L，Oligo(dT)18引物1 L，去RNase水9 L，混勻，置于70水浴5 min，立即置于冰中，在冰上再加入5倍稀釋緩沖液4 L，核糖核酸酶抑制劑1 L，dNTP(10 mmol/L) mix 2 L，混勻，室溫靜置5 min后再加入MMuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(2108 U/L) 1 L，總反應(yīng)體積為20 L. 42水浴60 min，70水浴1

13、0 min滅活，立即置于冰中5 min，完成cDNA第一鏈的合成.1.2.4 PCR擴(kuò)增抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)片段 取兩個(gè)滅菌的0.5 mL的離心管，在輕鏈PCR擴(kuò)增管中分別依次加入cDNA模板 20 L，輕鏈引物2 L，dNTP(10 mmol/L) 5 L，10倍稀釋緩沖液 10 L，DNA 聚合酶1 L，ddH2O 62 L. 重鏈PCR管：cDNA模板20 L，重鏈引物12 L，重鏈引物22 L，dNTP(10 mmol/L) 5 L，10倍稀釋緩沖液10 L，DNA聚合酶1 L，ddH2O 60 L. 95熱啟動(dòng)5 min后，進(jìn)行如下循環(huán)：94 30 s，53 45 s，72 60

14、s，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72延伸10 min，然后取5 L PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，用紫外分析儀檢測(cè)電泳結(jié)果，鑒定PCR產(chǎn)物片段大小.1.2.5 重鏈和輕鏈可變區(qū)片段與Linker的連接 擴(kuò)增出的抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)的PCR產(chǎn)物按Qiagen公司的QIAquick PCR 純化試劑盒中的說(shuō)明書進(jìn)行回收純化. 用瓊脂糖凝膠電泳，純化后的VH和VL與標(biāo)準(zhǔn)濃度的VH marker分別按11和12稀釋后上樣電泳進(jìn)行比較定量，根據(jù)條帶的亮度來(lái)估計(jì)基因片段的含量. 以相同和接近等摩爾濃度的抗體VH和VL基因混合進(jìn)行重組PCR反應(yīng)，按Pharmacia公司的

15、重組噬菌體抗體庫(kù)系統(tǒng)（RPAS）操作手冊(cè)進(jìn)行與Linker的連接PCR反應(yīng). 然后在PCR產(chǎn)物加上酶切位點(diǎn)后，取5 L PCR產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，用紫外分析儀檢測(cè)電泳結(jié)果，鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物片段的大小.1.2.6 連接片段的克隆 取一滅菌的0.5 mL的離心管，在每一管中依次加入純化的PCR產(chǎn)物17 L，Sfi I 1 L，10倍稀釋緩沖液2 L，50溫育2 h，酶切產(chǎn)物膠回收純化. 另取一滅菌的0.5 mL的離心管，在每一管中依次加入Sfi I酶切后的ScFv片段40 L，Not I 1 L，BAS 0.5 L，10倍稀釋緩沖液5 L，ddH2O 4.

16、5 L，37溫育3 h，酶切產(chǎn)物膠回收純化.1.2.7 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選 取4個(gè)滅菌0.5 mL的離心管，在每一管中依次加入純化的酶切后ScFv 40 L，pCANTAB 5E質(zhì)粒5 L，ATP(10 mmol/L) 5 L，T4 DNA連接酶1 L，5倍稀釋緩沖液6 L，ddH2O 3 L，24溫育1 h，每個(gè)連接產(chǎn)物分別進(jìn)行回收純化.1.2.8 感受態(tài)細(xì)菌的制備 用劃線法將大腸桿菌TG1接種于基本培養(yǎng)基平皿上，于37倒置培養(yǎng)過(guò)夜，再用無(wú)菌牙簽挑取一個(gè)單菌落至5 mL的培養(yǎng)液中，37振蕩（250 r/min）過(guò)夜培養(yǎng). 次日取菌液1 mL接種至含有100 mL培養(yǎng)液的500 mL燒瓶中，37

17、振蕩培養(yǎng)至吸光度（A600 nm）達(dá)到0.40.5時(shí)（約需23 h），4，2500 r/min離心15 min，棄上清液，再加10 mL預(yù)冷的TSS重懸菌體，完成制備感受態(tài)大腸桿菌，23 h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化.1.2.9 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 將4種純化連接產(chǎn)物分別按以下方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后收集的噬菌體抗體合并到一起組成噬菌體抗體庫(kù). 在無(wú)菌狀態(tài)下分別取1 mL新鮮感受態(tài)大腸桿菌TG1至兩個(gè)預(yù)冷的50 mL離心管中，置于冰中. 其中一個(gè)加入50 L純化的連接產(chǎn)物，另一個(gè)加入500 pg未經(jīng)酶切的pUC18質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物. 冰浴45 min. 將試管置于42水浴2 min使細(xì)胞熱休克，然后立即置于冰中

18、，轉(zhuǎn)化后，用質(zhì)粒pUC18來(lái)檢查其轉(zhuǎn)化效率. 取100 L轉(zhuǎn)化后至含有900 L的LBG（含20 mol/L葡萄糖的LB培養(yǎng)液）的試管中，37振蕩（250 r/min）培養(yǎng)1 h，分別取100，10，1 L的培養(yǎng)物在SOBAG瓊脂板（含100 mg/L氨芐青霉素和2 g/L葡萄糖的SOB培養(yǎng)基）上鋪盤，同樣方法另取100 L未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌TG1在SOBAG平板上鋪盤作為對(duì)照組. 37倒置培養(yǎng)過(guò)夜，次日計(jì)算菌落數(shù).1.2.10 噬菌體抗體庫(kù)的擴(kuò)增 取900 L轉(zhuǎn)化的大腸桿菌至一無(wú)菌的50 mL試管中，加入9.1 mL含10 g/L葡萄糖培養(yǎng)液，37振蕩（250 r/min）培養(yǎng)1 h后，再加50