硫辛酸對細胞DNA損傷保護作用的初步研究(1)

1、硫辛酸對細胞DNA損傷保護作用的初步研究(1)】 目的： 用單細胞凝膠電泳技術（SCGE）研究不同濃度過氧化氫（H2O2）分別作用于HepG2細胞2 h后DNA損傷的劑量效應關系，同時觀察硫辛酸對H2O2損傷細胞DNA的保護作用. 方法： 將細胞分為對照組、損傷組和保護組，依次加入不同濃度的H2O2及硫辛酸，應用SCGE檢測H2O2引起細胞DNA損傷. 結果： 隨著H2O2濃度的增加，細胞DNA的損傷程度加重，能使尾長、尾部DNA百分含量和尾距顯著增加（P0.05）. 硫辛酸能使H2O2損傷細胞的尾長、尾部DNA百分含量和尾距均較對照組減少（P0.05）. 結論： H2O2對細胞DNA損傷具有

2、劑量效應關系，硫辛酸可以有效地減少H2O2引起的細胞DNA的斷裂損傷.【關鍵詞】 過氧化氫；DNA；慧星試驗；硫辛酸0引言體內自由基代謝異?？梢詫е录毎鸇NA損傷，過氧化氫(H2O2)是自由基代謝過程中的一個重中間產物，在引起細胞DNA損傷過程中具有重作用. 硫辛酸作為一種有效的抗氧化劑，能抑制自由基對細胞的損傷1. 本研究利用可以快速、靈敏檢測出細胞DNA損傷的單細胞凝膠電泳技術（SCGE）來研究不同濃度H2O2分別作用于HepG2細胞2 h后DNA損傷的劑量效應關系，同時觀察硫辛酸對H2O2損傷DNA的保護作用，從而為探討細胞DNA損傷的機理提供直接證據，并篩選出有效的抗細胞DNA損傷的抗

3、氧化劑.1材料和方法1.1材料HepG2細胞系（本校病理學教研室惠贈），正常熔點瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、溴化乙錠(Sigma公司），其他試劑均為進口或國產分析純試劑.1.2方法將肝癌細胞株HepG2接種于12孔培養(yǎng)板中，分為對照組、損傷組和保護組3組，當細胞長至80%90%融合時（約24 h）損傷組分別加入H2O2，使其終濃度為0, 10, 100, 500, 1000, 2000 mol/L，保護組分別加入H2O2和硫辛酸，H2O2的終濃度為500 mol/L，硫辛酸終濃度為37.5 mol/L, 37培養(yǎng)2 h后消化細胞，加入PBS離心兩次后，用PBS將細胞濃度調至1106/L，放置于37水

4、浴鍋中備用. 每組細胞經臺盼藍染色，細胞存活率均大于90%. 單細胞凝膠電泳方法參照Singh等2方法略加改進后進行. 主步驟 鋪片： 第一層將正常熔點的瓊脂糖凝膠100 L鋪于載玻片；第二層將細胞懸液（細胞濃度為1106/L）50 L和低熔點的瓊脂糖凝膠450 L在37下混合，每張片子加80 L混合液，4放置10 min；第三層將低熔點的瓊脂糖80 L鋪于上述片子，4放置10 min. 裂解： 載玻片放入細胞裂解液（2.5 mol/L NaCl, 10 mmol/L Tris, 100 mmol/L Na2EDTA, 10 mL/L肌氨酸鈉 ,臨用前加入10 mL/L TritonX100,

5、 100 mL/L DMSO, pH=10），4裂解1.5 h. 電泳： 載玻片置入新鮮電泳液（300 mmol/L 乙酸鈉，100 mmol/L Tris, 100 mmol/L Na2EDTA, pH=10），靜置20 min，電壓15 V，電流300 mA,電泳1 h. 中和、染色： 預冷的Tris緩沖液（0.4 mmol/L, pH=7.4），中和30 min,滴加EB（15 mg/L） 40 L,加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察采集照片. 分析： 每組各選30個細胞，應用CASP （Comet assay software project）計算尾長、尾部DNA百分含量和尾矩.統(tǒng)計學處理：

6、采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包，統(tǒng)計方法采用KruskalWallis檢驗比較各組間尾部DNA含量、尾長及尾距的差異，以P0.05為有統(tǒng)計學差異，在各組間比較的基礎上，用MannWhitney 檢驗進行各組間兩兩比較，此時檢驗水準調整為0.003.2結果2.1H2O2損傷的劑量效應關系隨著H2O2濃度的增加，各指標數值逐漸增大（圖1，2），對照組與H2O2各劑量組之間尾長、尾部DNA百分含量和尾距差異均有顯著性（P0.025）；H2O2各劑量組之間各指標也具有顯著性差異（P0.025，表1）.圖1500 mol/L H2O2處理的細胞400（略）2.2硫辛酸對H2O2致DNA損傷的保護作用與對

7、照組（單純H2O2 500 mol/L處理2 h, 圖3）相比較，硫辛酸處理組（H2O2 500 mol/L，硫辛酸37.5 mol/L 處理2 h， 圖4）尾部DNA各指標減小，差異具有顯著性（P0.05，表2）.圖21000 mol/L H2O2處理的細胞400（略）表1H2O2作用2 h的HepG2細胞尾部DNA變化（略）aP0.05 vs對照組.圖3對照組細胞400（略）圖4硫辛酸處理組400（略）表2HepG2細胞經H2O2和硫辛酸共同處理后細胞尾部DNA變化（略）vs對照組.3討論DNA在生物學和醫(yī)學中起著十分重的作用，它帶有生物信息編碼，能夠控制多種生物功能，包括蛋白質的合成和遺

8、傳的性狀等等. 自由基能使DNA雙鏈斷裂和單鏈斷裂，使DNA的堿基變成自由基，并生成穩(wěn)定的氧化產物，常態(tài)下，細胞每消耗200個分子氧就會產生1分子氧化核酸. 因此，體內自由基代謝異常會導致細胞DNA損傷. H2O2是體內自由基代謝過程中一個重的中間產物，在引起細胞DNA損傷過程中起著非常重的作用，我們采用單細胞凝膠電泳技術檢測到這種損傷對于H2O2在一定范圍內有劑量依賴關系. 單細胞凝膠電泳是一種有效的檢測細胞DNA損傷的方法，它利用斷裂的DNA碎片在強堿條件下，從DNA的超螺旋結構中釋放出來，在電泳時移向陽極的特點，并在熒光染色后可在顯微鏡下觀察到尾部朝向陽極的彗星樣影像來對損傷的DNA進行

9、檢測3.作者：陳宏莉，海春旭，梁欣，張曉迪，劉瑞 【關鍵詞】過氧化氫Preliminary investigation on protective function 本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。損傷強度與細胞DNA的尾長、尾矩及尾部DNA含量呈正相關. 本實驗中隨著H2O2濃度增加，細胞DNA的尾長、尾矩及尾部DNA含量顯著增加（P0.05）. 由此可推測，當體內自由基累積造成損傷時，它對于細胞DNA的損傷可能在一定范圍內呈現劑量效應關系

10、，但體內是一個復雜的環(huán)境，與體外研究有著很大的區(qū)別，其造成DNA損傷情況還有待于進一步研究. 這將為研究抗氧化藥物以及藥物劑量提供重實驗依據.硫辛酸作為體內發(fā)現的一種重的抗氧化劑是一種八碳羧酸，存在于酮酸脫氫酶復合體中，該酶復合體由三種酶復合而成：酮酸脫氫酶、二氫硫辛酸轉?；负投淞蛐了崦摎涿? 其中二氫硫辛酸轉酰基酶促使?；D移給輔酶A生成酰基輔酶A. 硫辛酸是體內ATP產生過程中必不可少的輔因子，參與三羧酸循環(huán)，它能有效地對抗多種自由基，并可調節(jié)其他抗氧化劑，對機體有重的保護作用4. 硫辛酸可以增強維生素C及維生素E的效力，所以硫辛酸的存在對于抗氧化具有加乘的效果. 而且補充硫辛酸也能加

11、強其他抗氧化劑如維生素C, E及CoQ10等的利用率，能夠增強整體的抗氧化能力，尤其，能對抗線粒體利用氧氣時所產生的自由基，是最佳的線粒體抗氧化劑. 它具有脂溶與水溶的雙重特性，可以進入細胞的脂相與水相部分，在任何部位清除自由基，發(fā)揮“全能抗氧化劑”的作用5. 本實驗中，硫辛酸對由于H2O2造成的細胞DNA氧化損傷具有明顯的保護作用，處理組細胞尾長、尾部DNA百分含量和尾矩均較對照組明顯減少（P0.05），證明硫辛酸可以有效地減少H2O2引起的細胞DNA的斷裂損傷. 我們的研究表明，在體外硫辛酸可以有效對抗細胞DNA氧化損傷. 但是，硫辛酸發(fā)揮保護作用的有效劑量以及在體內的作用機制還有待于進一

12、步的研究.【參考文獻】1 Sethumadhavan S, Jayavelu T, Muthuswamy A, et al. Oxidative stress on mitochondrial antioxidant defense system in the aging process: Role of DLlipoic acid and Lcarnitine J. Clin Chim Acta, 2005,355(12):173-180.2 Singh NP, Mccoy MT, Tice RR, et al. A simple technique for quantification o

13、f low levels of DNA damage in individual cells J. Exp Cell Res, 1988,175:184-191.3 Sharbel WM. Monitoring DNA damage following radiation exposure using cytokinesisblock micronucleus method and alkaline singlecell gel electrophoresis J. Clin Chim Acta, 2004,347(12):15-24.4 Cheol KL, Thomas DP, Roger GK, et al. The impact of lipoic acid, coenzyme Q10 and caloric restriction on life span and gene expression patt