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文檔簡介
1、微生物限度檢查法標準操作規(guī)程制訂人/日期文件編碼:QC-FF-0039審核人/日期文件版本:00批準人/日期第1頁共 28 頁生效日期:年月日第份分發(fā)部門:質(zhì)量管理部、質(zhì)量控制部目的:建立微生物限度檢查法標準操作規(guī)程范圍:本規(guī)范適用于微生物限度檢查法檢查職責:質(zhì)量控制部全體人員內(nèi)容:第一部分:綜述1 簡述細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)是檢測非規(guī)定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的方 法。也是評價生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者衛(wèi)生 狀況的重要手段和依據(jù)。細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)除另有規(guī)定外均采用平板菌落計數(shù)法, 這是活菌計數(shù)的方法之一,也是目前國際上常用的一種方法。以瓊脂平
2、板上的細菌、霉 菌或酵母菌形成的一個獨立可見的菌落為計數(shù)依據(jù)。該法測定結(jié)果只反映在規(guī)定條件下 所生長的細菌(嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落數(shù),不包括對營養(yǎng)、 氧氣、溫度、PH 和其他因素有特殊要求的細菌、霉菌和酵母菌。一個細菌、霉菌或酵 母菌的菌落均可由一個或多個菌細胞生長繁殖而成。因此供試品中所測得的菌落數(shù),實 際為菌落形成單位數(shù),不應理解為細菌、霉菌、酵母菌的個數(shù)。在進行本法測定時,必須嚴格按本法所規(guī)定的條件操作,以免產(chǎn)生實驗誤差。2.設備與儀器2.1 設備2.1.1 無菌室 微生物限度檢查應有單獨的無菌室,每個無菌室應有獨立的凈化空氣 系統(tǒng)。2.1.1.1 結(jié)構和要求見中
3、國藥典二部無菌檢查法2.1.1.2 操作間 操作間應安裝空氣除菌過濾層流裝置。環(huán)境潔凈度不應低于10000級,局部潔凈度為 100 級(或放置同等級凈化工作臺)。操作間或凈化工作臺的潔凈空 氣應保持對環(huán)境形成正壓,不低于 4.9Pa。操作臺上備有電子天平,乙醇燈,火柴,乙 醇棉球,大、小橡皮乳頭等。2.1.1.3 緩沖間 緩沖間內(nèi)應有洗手盆,無菌衣、帽、口罩、拖鞋等。緩沖間內(nèi)不得微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第2頁共 28 頁放置培養(yǎng)箱和其他雜物。2.1.1.4 潔凈級別及檢查方法 通常采用塵粒數(shù)及浮游菌數(shù)或沉降菌數(shù)測定法(參照 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮
4、粒子、浮游菌、和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進 行潔凈度驗證。沉降菌數(shù)測定(法)無菌室操作臺消毒擦拭后,先啟動層流凈化裝置30mi n,將備妥的營養(yǎng)瓊脂平板 3 個(經(jīng) 30-35 預培養(yǎng) 48h,證明無菌落生長),以無菌方式(或 經(jīng)傳遞箱)移入操作間,置凈化臺左、中、右各1 個,開蓋,暴露 30min 后將蓋蓋上。在 30-35T培養(yǎng)箱內(nèi),倒置培養(yǎng) 48h,取出檢查。3 個平板生長的平均菌落數(shù)不超過 1 個。2.1.1.5 在每次操作前、后,用 0.1%苯扎溴銨溶液或其他消毒液擦拭操作臺及可能 污染的死角。然后啟動層流凈化裝置,同時用紫外殺菌燈照射30min。2.1.2 陽性菌試驗應另設單
5、獨的凈化工作臺,不得在供試品檢驗用的無菌室內(nèi)或凈化 工作臺上操作。2.1.3 無菌室與洗刷、滅菌消毒、培養(yǎng)、結(jié)果觀察及辦公間等配套設施應相對集中, 布局合理,避免污染,便于管理。2.2 儀器2.2.1 恒溫培養(yǎng)箱 (30-35C)、 生化培養(yǎng)箱 (20-25C)、 微波爐、 勻漿儀 (3000-8000r/min)或康氏振蕩器、恒溫水浴、電熱干燥箱(250-300C)、電冰箱、離心機、離心管、0.45 卩 m濾膜及薄膜過濾器、蒸汽滅菌器(使用時要進行生物指示劑滅菌效果檢查并應定期 請有關部門檢定)。菌落計數(shù)器、顯微鏡(1500 x)、電子天平或天平(感量 0.1g),系 列比色計。2.2.2
6、玻璃器皿錐形瓶(250-300ml,,內(nèi)裝玻璃珠若干;500ml, 1000ml)、培養(yǎng)皿(直 徑9cm)、量筒(100ml,500ml )、試管(18mmX 18mm 28mmX 198mm)及塞、吸管(1ml 分度 0.01,10ml 分度 0.1)、注射器(20ml 或 30ml 等)、注射針頭、載玻片、蓋玻片、 玻璃消毒缸(帶蓋)、不銹鋼桶(帶蓋)。玻璃器皿用前應洗滌干凈,吸管、量筒不掛水 滴,無殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距處塞入約 2cm 適宜疏松的棉花,置吸管筒內(nèi)或牛皮 紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應加硅膠塞或棉塞,若用振蕩器制備混懸液時,尚需用 玻璃紙包裹瓶塞,以免振蕩時供試液污染
7、瓶塞,再用牛皮紙包扎。玻璃器皿,均于高壓 蒸汽 121T滅菌 30min,烘干或 160C干熱滅菌 2h,備用。2.2.3 用具大、小橡皮乳頭(放于干凈帶蓋的容器中,并應定期用70%-75%乙醇溶液浸泡)。無菌衣、帽、口罩、手套(洗凈后配套,用牛皮紙包嚴)滅菌,備用也可用 一次性無菌衣、帽、口罩、手套。接種環(huán)(白銥金或鎳鉻合金,環(huán)徑 4-5mm、長度 6-10cm)、 乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第3頁共 28 頁樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋(
8、12cm)、實驗記錄紙等。3. 試液、稀釋劑和試劑3.1 試液3.1.10.1%苯扎溴銨溶液或其它適宜消毒液(供洗手、擦拭操作臺面用)。3.1.25%石碳酸溶液或其他適宜消毒液 (配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi), 供消毒帶菌 吸管用) 。3.1.375%乙醇溶液。3.1.4 碘酊或碘伏溶液。3.2 稀釋劑和試劑稀釋劑配制后,高壓蒸汽滅菌法滅菌。3.2.10.9%無菌氯化鈉溶液。3.2.2PH7.0 無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液。3.2.3 無菌聚山梨酯 80 氯化鈉一溶液。3.2.4PH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液。3.2.5PH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液按藥典附錄 配制后,過濾,分裝,滅菌。3.2.60.1%
9、無菌氯化三苯四氮唑溶液(TTC )。3.2.7PH7.2 無菌磷酸鹽緩沖液。4. 培養(yǎng)基4.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。4.2 培養(yǎng)基制備注意事項:采用干燥培養(yǎng)基,按說明配制,應對滅菌后的培養(yǎng)基PH 值進行校驗。若為自配培養(yǎng)基,原料應挑選,瓊脂凝固力應測定,以確定配制時瓊脂用量。試劑規(guī)格應為化學純 以上。4.3 配制的培養(yǎng)基不應有沉淀。如有沉淀,應于溶化后趁熱過濾,滅菌后使用。4.4 培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的 2/3,以免滅菌時溢出。包裝時,塞子必須塞緊, 以免松動或脫落造成染菌。4.5 培養(yǎng)基配制后應在 2h 內(nèi)滅菌,避免細菌繁殖。4.6 火菌后
10、的培養(yǎng)基應保存在 2-25C,防止被污染,可在三周內(nèi)用畢;保存于密閉 容器中,可在一年內(nèi)使用。制備好的培養(yǎng)基放置時間不宜過長,以免水分散失及染菌。4.7 用水浴或微波爐加熱溶化瓊脂培養(yǎng)基,勿用電爐直接溶化瓊脂培養(yǎng)基,以免營 養(yǎng)成分過度受熱而破壞。已溶化的培養(yǎng)基應一次用完,剩余培養(yǎng)基不宜再用。培養(yǎng)基不微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第4頁共 28 頁能反復加熱溶化。5. 供試品抽樣、保存及檢驗量5.1 抽樣5.1.1 一般采用隨機抽樣方法,其抽樣量應為檢驗用量(2 個以上最小包裝單位)的 3-5倍量(以備復試或留樣觀察)。5.1.2抽樣時,凡發(fā)現(xiàn)有異?;蚩梢?/p>
11、的樣品,應選取有疑問的樣品。機械損傷、明顯 破裂的包裝不得作為樣品。5.1.3 凡藥品、瓶口(外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍)外觀長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品, 可直接判為不合格品,無需再抽樣檢驗。5.2 保存5.2.1 供試品在檢驗之前,應保存在陰涼干燥處,勿冷藏或冷凍,以防供試品內(nèi)的污 染菌因保存條件不妥導致死亡,損傷或繁殖。5.2.2 供試品在檢驗之前,應保持原包裝狀態(tài),嚴禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作 為供試品。5.3 檢驗量5.3.1 所有劑型的檢驗量均需取自 2 個以上包裝單位(中藥蜜丸需取自 4 丸、膜劑取 4 片以上)。5.3.2 固體及半固體(黏稠性供試品)制劑檢驗量為10g。5.3.4
12、 液體制劑檢驗量為 10ml。5.3.4 膜劑除另有規(guī)定外,中藥膜劑檢驗量為 25cm2(中藥膜劑較厚,不宜取量過多),化學藥及生化藥膜劑檢驗量為 50cm2。5.3.5 特殊貴重或微量包裝的藥品,檢驗量可酌減。除另有規(guī)定外,口服固體制劑不 低于3g,液體制劑采用原液者不得少于 6ml,采用供試液者不得少于 3ml,外用藥品 不得少于 5g。5.3.6 要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加10g 或 10ml。5.3.7 包裝材料,除另有規(guī)定外其檢驗量 20 cm2。6. 試驗準備6.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管、量筒、稀釋劑 等經(jīng)傳遞窗移至無菌室內(nèi)。每次試驗所
13、用物品必須事先做好計劃,準備足夠用量,避免 操作中出入無菌間。編號后將全部外包裝(牛皮紙)去掉。6.2.開啟無菌室紫外殺菌燈和空氣過濾裝置,并使其工作不低于30min。6.3 關閉紫外殺菌燈后,操作人員用肥皂洗手,進入緩沖間,換工作鞋。再用0.1%微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第5頁共 28 頁苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手,穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。6.4 操作前先用乙醇棉球擦手,再用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供試品瓶、 盒、袋等的開口處周圍,待干后用滅菌的手術鑷或剪將供試品啟封。7.供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學特性,采取
14、適宜的方法制備供試液。如使用了乳化 劑、分散劑、中和劑或滅活劑,其用量應證明是有效的,并對微生物的生長和存活無影 響性。供試液的制備若需用水浴加溫時,溫度不應超過45C,30min。除另有規(guī)定外,常用的供試品制備方法如下:7.1 液體供試品 取供試品 10ml,加 無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液至 100ml,混勻, 作為供試液。油劑可先加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻,然后再加 0.9%無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液至100ml??扇苄砸后w制劑可用混合的供試品原液作為供試液。7.2固體、 半固體或黏稠液供試品 取供試品, 加0.9%無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液 至 100ml,用勻漿儀或其他有效
15、的方法,混勻,作為供試液。必要時加適量的無菌聚山 梨酯 80,并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。蜜丸等需剪碎,放入勻漿杯。7.3 非水溶性供試品軟膏、乳膏劑 先將已備妥滅菌的含司盤、單硬脂酸甘油脂、聚山梨脂 80 的混合 物融化,待冷至 45C時,加入供試品 5g (或 5ml),立即用玻棒攪拌均勻,分次少量慢 慢加入 45C的 PH7.0 無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液 80ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳 化,作為 1:20 供試液。7.3.2 油劑 取供試品 10ml,加入無菌聚山梨酯,搖勻,再加入 0.9%無菌氯化鈉一 蛋白胨緩沖液至 100ml7.3.3 栓劑 稱取供試品 10g,置滅菌
16、錐形瓶中,加適量 PH7.0 無菌氯化鈉一蛋白胨 緩沖液,置 45C水浴保溫 10min,使溶,加入無菌聚山梨酯 80,振搖使之乳化,再加 PH7.0 無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液(稀釋劑和聚山梨酯 80 總量為 100ml ),搖勻。7.3.4 眼膏劑取供試品 10g,加至含 20ml 無菌十四烷酸異丙酯(制法選用孔徑為 0.22 卩m)的脂溶性濾膜,以薄膜過濾法過濾除菌。濾器在140C干熱滅菌 2 小時,然后加入 45E的 PH7.0 無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液 100,振搖 5-10min,萃取,待油水明顯 分層,取其水層作為供試液。7.4 非水溶性膜劑供試品 化學藥膜劑一般取樣為 100cm
17、2,置滅菌錐形瓶中,加入 適量的PH7.0 無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液,于 45C水浴中保溫,浸泡,振搖,以供試品 浸液作為供試液。中藥膜劑取,剪碎,加適量的 PH7.0 無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液(通微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第6頁共 28 頁常加 1ml 或 2ml),浸泡,振搖,以供試品浸液作為供試液。7.5 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 取供試品 10g,腸溶制劑加 PH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液 至100ml,結(jié)腸溶制劑加 PH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液至 100ml,均置錯誤!未找到引用源。水 浴中,振搖,使溶解,作為供試液。7.6 氣霧劑、噴霧劑供試
18、品 取規(guī)定量供試品,置冰箱冰凍室內(nèi)約 1h。取出,速消 毒供試品容器的開啟部位周圍,用無菌鋼錐在容器上消毒部位鉆一小孔,在室溫輕輕轉(zhuǎn) 動容器,使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液,加至適量的PH7.0 氯化鈉無菌一蛋白胨緩沖液(若含非水溶性成分,加適量的無菌聚山梨酯80)中,混勻,取相當于 10g 或 10ml 的供試品,再稀釋成 1:10 的供試液。7.7 茶劑 取供試品 10g,置滅菌錐形瓶中,加入稀釋劑 100ml,振搖 2-3min,以滅 菌紗布過濾(如為袋泡茶,可直接取 2 袋,以稱樣結(jié)果按 1:10 加稀釋劑,浸泡 30min)以上供試品如吸水膨脹,或黏度過高,可增加稀釋
19、劑的量,制成 1:20-1:100 供試液。7.8 具抑菌活性的供試品 當供試品具有抑菌活性時,應消除供試液的抑菌活性后, 再依法檢查。常用的方法如下:7.8.1 稀釋法 取規(guī)定量的供試液,加至較大量的培養(yǎng)基中,使單位體積內(nèi)的供試品 含量減少至不具抑菌作用。用平板法測定菌數(shù)時,1ml 供試液可等量分注多個平皿;控制菌檢查時,可加大增菌培養(yǎng)基的用量。培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強的制劑。7.8.2 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量的供試液,3000r/min 離心 20min,棄去上清液, 留底部集菌液約 2ml,加稀釋劑至原規(guī)定量。如供試液中有不溶顆粒、沉淀,先以 500r/min,離心5min,留離
20、心沉淀物,取全部上清液按上述高速再離心,留底部集菌液 約 2ml,加稀釋劑至原規(guī)定量。7.8.3 薄膜過濾法見細菌、霉菌和酵母菌計數(shù) 。7.8.4 中和法 凡含汞、砷或防腐劑等的供試品,可用相應的試劑鈍化、中和其抑菌 活性,制成供試液。7.9 包裝材料供試品取試樣用開孔面積為 20cm2的消毒過的金屬模板壓在內(nèi)層表面上,將無菌棉簽用氯化鈉注射液稍沾濕,在板孔范圍內(nèi)擦抹5 次,換 1 支棉簽再擦抹5 次,每個位置用 2 支棉簽共擦抹 10 次,共擦抹 5 個位置 100 cm2。每支棉簽抹完后立 即剪斷(或燒斷),投入盛有 30ml 無菌生理鹽水的錐形瓶(或大試管)中。全部擦抹棉 簽投入瓶中后,
21、將瓶迅速搖晃 1 分鐘,即得供試液。8.供試液的釋?。?0 倍遞增稀釋法)8.1 取 3-4 支滅菌試管,分別加入 9mlPH7.0 無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液。加稀釋劑 后,試管塞應立即塞上。微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第7頁共 28 頁8.2 另取 1 支 1ML 滅菌吸管吸 1:10 均勻供試液 1ml,加入裝有 9mlPH7.0 無菌氯化 鈉一蛋白胨緩沖液的試管中,(此時操作一般為左手執(zhí)試管并將塞打開,傾斜,右手執(zhí) 10ml 吸管吸量。切勿在乙醇燈焰峰的正上方操作,以免燈焰將供試液中的菌細胞殺滅)混勻,即 1:100;供試液。以此類推,根據(jù)供試品
22、污染程度,可稀釋至1:103、1:104等適宜稀釋級(3-4)。每遞增 稀釋級,必須另換一支吸管。在作 10 倍遞增稀釋時,吸管 插入第 1 級稀釋液內(nèi)不低于液面 2.5cm,反復吸吹約 10 次。吸液時,應先吸至高于吸管 上部刻度少許,然后提起吸管,貼于試管內(nèi)壁,調(diào)整液量至刻度,吸管移至第2 級稀釋管的內(nèi)壁近液面處(勿接觸液面),緩慢地放出全部供試液(吸管內(nèi)應無粘附或殘留液 體),然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。9.計數(shù)方法驗證由于某些供試品具有抗菌活性,在建立測定方法或原測定法的檢驗條件發(fā)生改變 時,可能影響檢驗結(jié)果的準確性,必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進行驗 證。驗證時,按供試液的
23、制備和細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法進行。對各試驗 菌的回收率應逐一進行驗證。9.1 驗證用菌株 大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌,枯草芽抱桿菌,白色念珠菌,黑曲 霉接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基; 白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,培養(yǎng) 24-48h,黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改 良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基,培養(yǎng) 5-7 天。用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含 500-1000 個 cfu 的菌懸液。9.2 驗證方法 驗證試驗分四組,至少應進行 3 次獨立的平行試驗,并分別計算供試 品組和對照組試驗的菌回收率。9.2.1 試驗組 取最低稀釋級的供
24、試液,按每 1ml 供試液加入 50-100cfu 試驗菌,按 菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。平皿法計數(shù)時,取試驗菌液、供試液分別注入平皿中,立即 傾注瓊脂培養(yǎng)基;薄膜過濾法計數(shù)時,取供試液2ml 過濾,沖洗液沖洗,并在最后一次的沖洗液中加入試驗菌。9.2.2 菌液組 取上述試驗菌液,測定其加入的試驗菌菌數(shù)。9.2.3 供試品對照組 取最低稀釋級的供試液 1ml,按菌落計數(shù)方法測定其所含菌數(shù)。9.2.4 釋釋劑對照組為考察供試液制備過程對微生物的影響程度,可用相應的稀釋 液替代供試液,加入試驗菌,使最終菌濃度為每1ml 含 50-100cfu,按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。9.2
25、.5 試驗組的菌回收率(%)=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)”菌液 組的平均菌落數(shù)X100%微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第8頁共 28 頁926 稀釋劑對照組的菌回收率(%)=稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌 落數(shù)x100%9.3 結(jié)果判定稀釋劑對照組的菌回收率均應不低于 70%。若試驗組的菌回收率均不 低于70%,則可按該供試液制備方法和菌落計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌或酵母菌 數(shù);若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于 70%,應建立新的方法,消除供試品的抑菌 活性,并重新驗證。9.4 驗證試驗可與供試品的細菌,霉菌及酵母菌計數(shù)同時
26、進行。9.5 注意事項9.5.1 所用標準菌種的傳代次數(shù)不得超過 5 代。以冷凍干燥的原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種培 養(yǎng),其培養(yǎng)物為第一代。9.5.2 黑曲霉菌的菌液制備將黑曲霉菌的抱子接種至真菌瓊脂斜面培養(yǎng)基上,于 20-25E培養(yǎng) 5-7 天,使大量的抱子產(chǎn)生。加入 3-5ml 的 0.9%無菌氯化鈉溶液,用無菌 玻棒或接種環(huán)輕輕將抱子洗脫。然后,用一支10ml 無菌球形毛細吸管,其管口用無菌棉花或紗布包扎且能過濾菌絲的裝置,吸出抱子菌液至無菌試管內(nèi),用比濁法,將菌液 稀釋至每毫升含 10-100cfu。9.5.3 做試驗菌的回收率試驗時,加入菌量以 50-100cfu 為宜。加菌量過多,如薄膜 法
27、,菌落擁擠,則不好計數(shù);加菌量過少,如小于30 個,則誤差大。10 檢查法10.1 平皿法10.1.1 在上述進行 10 倍遞增稀釋的同時,以該稀釋級吸管,吸取該稀釋級供試液各 1ml至每個直徑 90mm 的滅菌平皿中,或從高稀釋級至低稀釋級吸液時可用1 支吸管吸供試液各 至每個滅菌平皿中。每一稀釋級每種培養(yǎng)基至少注2-3 個平皿(一般為左手執(zhí)平皿,將蓋半開,右手執(zhí)吸管),注皿時,將 1ml 供試液慢慢全部注入平皿中,管內(nèi) 無殘留液體,防止反流到吸管尖端部。一般取適宜的連續(xù)2-3 個稀釋級的供試液進行細菌、霉菌和酵母菌數(shù)測定。10.1.2 陰性對照 待各級稀釋液注皿完畢后,用 1 支 1ml
28、吸管吸取稀釋劑(PH7.0 無 菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液)各 1ml,分別注入 4 個平皿中。其中 2 個作細菌數(shù)陰性對照; 另 2 個作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對照,如另用 ypd 瓊脂測定酵母菌數(shù)時,則再增加 2 個平 皿作酵母菌數(shù)陰性對照。10.1.3 傾注培養(yǎng)基:將預先配制好的細菌計數(shù)用的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;霉菌、酵母菌 計數(shù)用的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基;含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(霉菌) 和瓊脂培養(yǎng)基(酵母菌)溶化,冷至約 45C時,傾注上述各個平皿約 15ml,以順時針微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第9頁共 28 頁或逆時針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿,使供
29、試液或稀釋液與培養(yǎng)基混勻,置操作平臺上待凝。在 旋轉(zhuǎn)平皿時切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上。10.1.4 培養(yǎng):一般細菌計數(shù)平板倒置于 30-35E培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72h。霉菌、酵母菌 計數(shù)平板倒置于 20-25C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 120h。10.1.5 菌落計數(shù)10.1.5.1 一般將平板置菌落計數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點計,以透射光襯 以暗色背景,仔細觀察。勿漏計細小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落。注意細菌菌落、 霉菌菌落和酵母菌菌落與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、油滴等的鑒別。必要時用 放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察,或挑取可疑物涂片鏡檢。10.1.5.2 供試品如為微生物制劑,應將有效微
30、生物菌落排除,不可點計在細菌、霉 菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法需按該制劑微生物品種而定,并須觀察菌落特征及染色形 態(tài)O10.1.5.3 供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料,培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物,經(jīng)過培養(yǎng)后有時形成數(shù)量很多的有形物,且難與菌落相鑒別。為了有利于菌落計數(shù),可 在操作時將適宜稀釋級的供試液多增加注皿(1-2 個平皿),注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱(勿結(jié)凍)中,在計數(shù)菌落時作為對照?;蛴?.001%TTC 營養(yǎng)瓊脂注皿,經(jīng)培養(yǎng)后該培養(yǎng)基生長的菌落為紅色,襯于白色背景上易于點計細菌菌落和區(qū)分其他有形物。有 些軟膏等非水溶性供試品,經(jīng)營養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色,培養(yǎng)后生長的菌落不易辨認和
31、點計,為防止這種情況,也可用錯誤!未找到引用源。營養(yǎng)瓊脂注皿。10.1.5.4 若平板上有 2 個或 2 個以上菌落重疊,肉眼可辨別時仍以 2 個或 2 個以上 菌落計數(shù);若平板生長有鏈狀或片狀、云霧狀菌落,菌落間無明顯界線時,一條鏈、片 作為一個菌落計,但若鏈、片上出現(xiàn)性狀與鏈(片)狀菌落不同的可辨菌落時,仍應分 別計數(shù),若生長蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落, 其外緣有若干性狀相似的單個菌 落, 一般不宜作為計數(shù)用。10.1.5.5 若各稀釋級 2 個平板菌落的平均數(shù)在 15 以上,同稀釋級二平板菌落數(shù)相差 1 倍時,該稀釋級菌落數(shù)不得作為計數(shù)依據(jù);當 2 個平板菌落均數(shù)在 15(含 15
32、)以下時, 兩個平板菌落數(shù)的差值允許范圍為0-4,1-7,2-9,3-10,4-12,5-14,6-15,7-17,8-18,9-19,10-20.超出以上范圍即視為操作誤差,不得作為計數(shù)依據(jù)。10.1.5.6 菌落生長呈蔓延趨勢者,細菌,霉菌需逐日作初步點計,在點計霉菌菌落 時,輕輕翻轉(zhuǎn)平板,勿反復翻轉(zhuǎn),否則使早期形成的抱子散落在平板的其他部位,又萌 生新的霉菌菌落,導致計數(shù)誤差。10.1.5.7 在 48h 點計細菌,120h 點計霉菌時,如菌落極小,不易辨認,可延長培養(yǎng)微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第10頁共 28 頁時間至 7 天,再點計菌落數(shù)。
33、10.1.5.8 對有疑議的供試品以 YDP 培養(yǎng)基作酵母菌計數(shù)時, 可培養(yǎng)至 1 周再點計菌 落數(shù)。10.1.5.9 含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基點計霉菌數(shù),YDP 瓊脂培養(yǎng)基點計酵母菌數(shù)。兩者計數(shù)值合并報告。10.1.5.10 在特殊情況下,若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長有霉菌和酵母菌其數(shù)量多于玫瑰 紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上生長的霉菌和酵母菌,或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上生長的細菌數(shù)多于營 養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長的細菌數(shù),以菌落數(shù)多的培養(yǎng)基中的菌數(shù)報告結(jié)果。10.1.5 菌數(shù)報告規(guī)則宜選取細菌、酵母菌平均菌落數(shù)在 30-300 之間、霉菌平均菌落數(shù)在 30-100 之間的 稀釋級,作為菌數(shù)報告的依據(jù)。1
34、0.1.6.1 當僅有 1 個稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定, 以該級的平均菌落數(shù)乘以稀釋 倍數(shù)的值報告菌數(shù)。10.1.6.2 當有 2 個相鄰稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時,視兩者比值(比值=(高稀釋級平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù))/(低稀釋級平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù))而定。若比值小于或等 于2,以兩稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報告菌數(shù);若比值大于 2 但不超過 5 時,以低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告菌數(shù);當出現(xiàn)比值大于5,甚至高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時,應查明原因再行檢查,必要時,應進行 方法的重新驗證10.1.6.3 當各稀釋級的平均菌落數(shù)均小于 30,以最低稀釋級的平
35、均菌落數(shù)乘以稀釋 倍數(shù)的值報告菌數(shù).10.1.6.4 如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但 平均菌落數(shù)小于 1 時,以小于 10 報告菌數(shù)。10.2 薄膜過濾法10.2.1 取濾膜孔徑不大于 0.45 卩 m,直徑不小于 50mm 可拆卸的濾器。根據(jù)供試品 及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法進行滅菌。 使用時, 必須保證濾膜在過濾前后的完整性。10.2.2 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾 膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液 及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過
36、濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾 膜每次沖洗量為100ml,沖洗液、沖洗量及沖洗方法同方法驗證試驗。每片濾膜的總過 濾量不宜過大,以避免濾膜上的微生物受損傷。微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第11頁共 28 頁1023 每張濾膜取相當于 1g 或 1ml 供試品的供試液直接過濾,或加至適量稀釋劑 中,混勻,過濾。若供試品 1g 或 1ml 含菌較多,可選適宜稀釋級的供試液,過濾。用PH7.0 無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液或其它適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法和沖洗量同“計數(shù)方法的驗證”。沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊膽培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂 培養(yǎng)基或酵母浸
37、出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。 濾膜貼于平板上時不得有空隙或氣泡,否則影響微生物生長。10.2.4 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋劑 1ML 同法操作,作為陰性對照。陰性對照 不得有菌生長。10.2.5 培養(yǎng)和計數(shù) 培養(yǎng)及菌落計數(shù)方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數(shù)應不多于 100 個。如菌落數(shù)超過 100 個,不便計數(shù)時,可取高稀釋級的供試液同法操作,點計濾 膜上的菌落數(shù)。10.2.6 菌數(shù)報告規(guī)則 以相當于 1g 或 1ml 供試品的菌落數(shù)報告;若濾膜上無菌落生 長,以v1 報告菌數(shù)(每張濾膜過濾 1g 或 1ml 供試品),或v1 乘以稀釋倍數(shù)的值報告 菌數(shù)。1
38、0.3 培養(yǎng)基稀釋法:取低稀釋級供試液(原液或 1:10 供試液)2 份,每份各 1ml,分別注入 5 個或 5 個 以上平皿中(每皿 0.2ml 或v0.2ml),每 1 個平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約 15ml,混勻, 凝固后,倒置培養(yǎng),計數(shù)。每 1ml 供試液等量分注 5 個或 5 個以上平板點計的菌落數(shù) 之和,即為每 1ml的菌落數(shù),共得 2 組數(shù)據(jù)。以 2 份低稀釋級供試液菌落數(shù)的平均數(shù)乘 以稀釋倍數(shù)的值報告。10.4 結(jié)果報告10.4.1 菌落數(shù)在 100 以內(nèi)時,按實有數(shù)據(jù)報告。10.4.2 菌落數(shù)大于 100 時,取兩位有效數(shù)字報告,第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。10.5 復試供試品細
39、菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任一項一次檢驗不合格,應從同一批樣品中隨 機重新取 2 倍包裝量的供試品,依法作單項復試兩次,以三次檢驗結(jié)果的均值報告。若 3 次結(jié)果的平均值不超過該品種項下的規(guī)定,判供試品符合規(guī)定;否則,判供試品不符 合規(guī)定。11 .注意事項11.1 供試品檢驗全過程必須符合無菌技術要求。使用滅菌用具時,不能接觸可能污 染的任何器物,滅菌吸管不得用口吹吸。11.2 供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基,不得超過小時。否則,可能導致微生物微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第12頁共 28 頁繁殖或死亡而影響計數(shù)結(jié)果。11.3 供試液稀釋及注皿時應振搖后取均
40、勻的供試液,以免造成實驗誤差。11.4 為避免細菌菌落蔓延生長,宜采取下列方法處理:11.4.1 開蓋干燥 將已凝固的瓊脂平板開蓋,倒置斜放于凈化工作臺上,開機后合蓋, 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。11.4.2 換陶瓦蓋 將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。11.4.3 加 TTC 于傾注培養(yǎng)基前,在每 1000ml 營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌 1%TTC 溶液 1ml(最終濃度為 0.001%),混勻后傾注平皿。12.檢驗報告書寫本品按中國藥典微生物限度檢查法檢驗,結(jié)果符合或不符合規(guī)定。第二部分:控制菌檢查1. 方法驗證在建立供試品的控制菌檢查法或原檢查法的檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果 的準確性時
41、,應對供試品的抑菌活性及檢查法的可靠性進行驗證。驗證時,按各供試品 微生物限度項下的規(guī)定(給藥途徑)選擇相應的菌株,并按供試液的制備和控制菌檢查 法所規(guī)定的方法進行。2. 儀器、設備及用具見各控制菌檢查項下。3. 試液、指示液見各控制菌檢查項下。4. 培養(yǎng)基見各控制菌檢查項下。5. 驗證用菌株及菌液制備5.1 菌種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、生抱梭菌。5.2 菌液制備分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單 胞菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許,各接種至 5ml 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi),置 36C1C培養(yǎng) 18-24h,取均勻培養(yǎng)物 1ml 用 0.9%無
42、菌氯化鈉溶液稀釋制成每 1ml 含菌 10-100cfu 的菌 懸液,其菌數(shù)在做對照試驗的同時用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布,經(jīng)培養(yǎng)后計數(shù)確定。生 抱梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,培養(yǎng) 18-24 小時。用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成 1ml 含 10-100cfu 的菌液。6.供試液的制備 見細菌、 霉菌和酵母菌計數(shù)7 。7. 驗證方法7.1 試驗組 取規(guī)定量供試液及 10-100cfu 試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中,依相應控制菌微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第13頁共 28 頁檢查法進行檢查。驗證大腸菌群檢查法時,應采用大腸埃希菌作為試驗菌。當采用薄
43、膜 過濾法時,試驗菌應加在最后一次沖洗液中,沖洗后,取出濾膜接種到增菌培養(yǎng)基中。7.2 陰性對照組設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的特異性,方法同試驗組,驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球 菌:驗證銅綠單胞菌、 金黃色葡萄球菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。 陰性對 照菌不得檢出。8 結(jié)果判定 陰性對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌,按此供試液制 備法和控制菌檢查法作該供試品的控制菌檢查;若試驗組未檢出試驗菌,應參照細菌、 霉菌和酵母菌計數(shù) 7.8 具抑菌活性的供試品項下操作,以消除供試品的抑菌活性。建立 新的方法,并重新驗證。驗證試驗
44、可與供試品的控制菌檢查同時進行。第三部分:大腸埃希菌檢查1 簡述大腸埃希菌即大腸桿菌,為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌個種。大腸埃希菌 是人和溫血動物腸屬除大腸埃希菌外, 新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃希菌等道內(nèi)的棲居菌, 隨糞 便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌, 表明該樣品受到人和溫血動物的糞便污染, 即 可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌,可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康,口服藥品必須檢 查大腸埃希菌。用 4甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)和靛基質(zhì)試驗檢查大腸埃希菌是一 項新技術,其檢驗步驟為:增菌培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng),多數(shù)情況下不需要從混合
45、菌中分離單個菌,如 MUG、試驗為陽性或陰性即可報告結(jié)果。原理:利用目標菌限定酶作用的底物的水解產(chǎn)物,產(chǎn)生顏色或熒光反應作為指示系 統(tǒng)來鑒定目標菌。2 儀器、設備及用具2.1 無菌室參照細菌、霉菌和酵母菌計數(shù) 2.1.1 。2.2 凈化工作臺。2.3 培養(yǎng)箱(36C仁C)。2.4 高壓蒸汽滅菌器。2.5 顯微鏡(1500X)。2.6 微波爐。2.7 恒溫水?。?5C1C)。2.8 離心機(500-4000r/min)。微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第14頁共 28 頁2.9 0.45 卩 m 0.02 卩 m 薄膜及過濾器。2.10 電冰箱。2.11 勻
46、漿儀。2.12 365nm 紫外燈。2.13 玻璃器皿、器具參照細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)2.2.2。3 試液、指示液參見中國藥典二部附錄。4 培養(yǎng)基參見中國藥典二部附錄。5 對照用菌液,參見控制菌檢查 5.2.6 準備6.1 供試液的制備6.2.1 液體供試品見細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)7.1 6.2.2 固體、半固體或黏稠液供試品見細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)7.206.2.3 非水溶性供試品見細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)7.3o6.2.4 含抑菌成分供試品 供試品按常規(guī)檢查法,加入規(guī)定量的對照菌,不能檢出時, 表明供試品有抑菌活性。該供試液須按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后,依法 檢查。同時做陽性和陰
47、性對照。6.2.4.1 稀釋法取規(guī)定量的供試液接種到較大體積的培養(yǎng)基中,使該供試液稀釋至 不具抑菌作用的濃度。6.2.4.2 離心沉淀集菌法取規(guī)定量的供試液于無菌刻度離心管中,3000r/min 離心30min,移去上清液,留底部集菌液約2ml,并稀釋該供試液至原規(guī)定量。如有不溶性藥渣,可先以 500r/min 離心 5min,取全部上層液,再按上述方法集菌處理。6.2.4.3 薄膜過濾法 取規(guī)定量的供試液于稀釋劑 100ml 中,搖勻,以無菌操作加入 裝有直徑約 47mm、孔徑不大于 0.45 卩 m 0.02 卩 m 微孔濾膜的薄膜過濾器內(nèi),過濾, 用稀釋劑沖洗濾膜,每次不少于 100ml
48、,將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜,加入增菌培養(yǎng) 基中。6.2.4.4 中和法 取規(guī)定量含磺胺類的供試品,于100ml 增菌液(含 1%對氨基苯甲酸約 1-5ml)中;含砷、汞類的供試品,于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml 中;含洗必泰供試品,于含適量聚山梨酯 80 等表面活性劑的 100ml 增菌液中(表面活性劑的用量應預試, 用量過大有抑菌作用)。6.2.4.5 沉降法 取規(guī)定量供試液,自然沉降 5min,取上層液于 100ml 增菌液中,本微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第15頁共 28 頁法適用于難溶于水的抗菌制劑。7.操作步驟7.1 檢驗程序陽性對照試驗各供
49、試品進行控制菌檢查時,應做陽性對照試驗。陽性對照試驗的 加菌量為 10-100cfu,供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的各控制菌檢查。陽性 對照試驗應檢出相應的控制菌。已做驗證試驗的供試品,在該供試品檢查時不必再做陽 性對照。陰性對照試驗 取稀釋劑 10ml 加入 100ml (或 200ml)相應控制菌檢查用的增 菌培養(yǎng)基中,培養(yǎng),應無菌生長。7.2 增菌培養(yǎng) 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基 2 份,每份各 100ml。1 份加入 10ml 供試液(相當 于供試品 1g、1ml、10cm2),另 1 份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。 培養(yǎng) 18-24 小時,必要時可延至 48 小時。陰性對照應無
50、菌生長。取上述培養(yǎng)物 0.2ml,接種至含 5mlMUG 培養(yǎng)基的試管內(nèi),培養(yǎng),于 5、24 小時在 365nm紫外光下觀察,同時用未接種的 培養(yǎng)基作本底對照。在紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物 呈現(xiàn)藍白色熒光,MUG 為陽性;不呈現(xiàn)熒光,為 MUG 陰性。觀察后,沿培養(yǎng)管的管 壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液,液面呈玫瑰紅色,為靛基質(zhì)陽性;呈試劑本色,為靛基質(zhì)陰性。 本底對照的 MUG 和靛基質(zhì)試驗應為陰性。如 MUG 陽性、靛基質(zhì)陽性,判供試品檢出 大腸埃希菌;如 MUG 陰性、靛基質(zhì)陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌。7.3 分離培養(yǎng) 如呈現(xiàn) MUG 陽性、靛基質(zhì)陰性或 MUG 陰性、靛基質(zhì)陽性時,應將 上述供試品
51、 增菌培養(yǎng)液輕輕搖動,以接種環(huán)沾取 1-2 環(huán)培養(yǎng)液劃線于 EMB 或麥康凱瓊 脂平板上,培養(yǎng) 18-24h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與中國藥典二部所列的菌 落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出大腸埃希菌。7.4 純培養(yǎng)如 EMB 或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與中國藥典二部所列特征相符 或疑似者,以接種針輕輕接觸單個疑似菌落的表面中心,沾取培養(yǎng)物,應挑選2-3 個以上疑似菌落,分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面,培養(yǎng) 18-24h,作以下檢查。如平板上無單個可疑菌落,但有可疑菌團(紫黑色,或有金屬光澤),應沾取可疑菌團培養(yǎng)物少許,或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于 EMB 瓊脂平板,培養(yǎng) 18-24h, 再
52、挑選單個疑似菌落,純培養(yǎng),作以下檢查。7.5 革蘭染色、鏡檢7.5.1 以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上,取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培 養(yǎng)物少許,制成均勻涂片,自然或微溫干燥,再通過火焰2-3 次(載玻片不燙手)固定。7.5.2 滴加結(jié)晶紫染液,染色 1min,水洗。7.5.3 滴加碘液,媒染 1min,水洗,以濾紙吸干余水。微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第16頁共 28 頁7.5.4 滴加 95%乙醇,脫色,水洗。7.5.5 滴加沙黃染液,復染,待干后,鏡檢。7.5.6 染色結(jié)果7.5.6.1 革蘭陽性菌呈藍紫色;革蘭陰性菌呈紅色。7.562 大
53、腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌,或球桿菌狀,亦有桿菌狀。7.5.7 注意事項7.5.7.1 玻片必須潔凈,無劃痕。涂片的菌量宜少,菌不可濃。否則,菌細胞成堆或 連成片。不利菌細胞染色反應判斷及形態(tài)觀察。7.5.7.2 培養(yǎng)物的菌齡以 16-24h 為宜。培養(yǎng)時間過長,革蘭陽性菌易染成紅色。7.5.7.3 脫色是關鍵。脫色時間不足,菌細胞易染成陽性;脫色時間過長,菌細胞易 染成陰性。7.5.7.4 可用已知革蘭染色為陽性、陰性的菌種做染色的質(zhì)量控制。8.生化試驗8.1 乳糖發(fā)酵試驗取上述斜面培養(yǎng)物,接種于乳糖發(fā)酵管,培養(yǎng)18-24h,觀察產(chǎn)酸(指示劑為酸性品紅者為紅色;指示劑為溴麝香草酚藍者為黃色),
54、產(chǎn)氣(小倒管內(nèi)有氣泡,氣泡無論大?。?。為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性,亦可接種乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細菌,可于出現(xiàn)陽性。或適當延長培養(yǎng)時間。8.2 靛基質(zhì)試驗(I)取上述斜面培養(yǎng)物,接種于蛋白胨水培養(yǎng)基,培養(yǎng)24-48h,沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴, 輕輕搖動試管, 液面呈玫瑰紅色為陽性, 呈試劑本色為陰 性。 98%的大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗為陽性,一般 24h 即可出現(xiàn)陽性結(jié)果。常以無菌操作 先從管中取出1ml 或 2ml 培養(yǎng)液進行檢查,如靛基質(zhì)陰性,余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培 養(yǎng) 24h,作靛基質(zhì)試驗。8.3 甲基紅試驗(M)取上述斜面培養(yǎng)物,接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中,培 養(yǎng)
55、48土 2h,于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液 2-3 滴(約每 1ml 培養(yǎng)液加指示液 1 滴),輕 微搖動,立即觀察,呈鮮紅色或橘紅色為陽性,呈黃色為陰性。8.4 乙酰甲基甲醇生成試驗(V P)取上述斜面培養(yǎng)物,接種于磷酸鹽葡萄糖胨水 培養(yǎng)基中,培養(yǎng) 48 土 2h,于 2ml 培養(yǎng)液中加入。a萘酚乙醇試液 1ml,混勻,再加 40% 氫氧化鉀試液 0.4ml,充分振搖,在 4h (通常在 30min)內(nèi)出現(xiàn)紅色判為陽性,無紅色 反應為陰性。8.5 枸櫞酸鹽利用試驗(C)取上述斜面培養(yǎng)物,接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面培養(yǎng) 基上,培養(yǎng) 2-4 天,培養(yǎng)基斜面有菌苔生長,培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時為陽性,培
56、養(yǎng)基 顏色無改變、無菌苔生長為陰性。微生物限度檢查法標準操作規(guī)程9.結(jié)果判定9.1 當陰性對照試驗呈陰性,陽性對照試驗 MUG 呈陽性、靛基質(zhì)陽性,供試品 MUG 陽性、靛基質(zhì)陽性,報告 1g 或 1ml 供試品檢出大腸埃希菌;MUG 陰性、靛基質(zhì)陰性, 報告 1g或 1ml 供試品未檢出大腸埃希菌。9.2MUG 陽性、靛基質(zhì)陰性、IMViC 試驗為-+-、革蘭陰性桿菌,報告 1g 或 1ml 供 試品檢出大腸埃希菌;MUG 陰性、靛基質(zhì)陽性、IMViC 試驗為+-、革蘭陰性桿菌, 報告 1g 或1ml 供試品檢出大腸埃希菌。9.3 供試品培養(yǎng)物檢查不符合 9.2 中的任一項, 報告 1g 或
57、 1ml 供試品未檢出大腸埃 希菌。9.4 當陰性對照有菌生長或陽性對照未生長或生長但非大腸埃希菌,不能做出檢驗 報告。10 注意事項10.1MUG 法不必從混合菌中分離單個菌落。除大腸埃希菌外,尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株;以及少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽抱菌,其 MUG 為陽性。因此,在 MUG 培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉的量,可排除革蘭陽性菌的干擾。至于志賀菌、 沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長,即使有生長,本法能檢出亦判為不合格。10.2 配制 MUG 培養(yǎng)基時,務必校正 PH 值,滅菌后 PH 不得過 7.4,否則 PH 值偏 高,MUG 分解,本身則顯熒光;分裝 MUG 培養(yǎng)基
58、的試管應挑選,試管、蛋白胨不得10.3 培養(yǎng)時間 供試品培養(yǎng)液接種于 MUG 培養(yǎng)基中,一般培養(yǎng) 5h 和 24h 要觀察是 否產(chǎn)生熒光,如熒光很微弱,不能準確判斷時,可延長培養(yǎng)至48h 再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的 GUD 的活性不完全相同,對底物濃度反應的差異;培養(yǎng)基中選擇 因子的影響;培養(yǎng)時間、溫度;PH 值的改變;大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾 等,對結(jié)果的判斷亦有影響。10.4 結(jié)果觀察 取供試品的 MUG 試驗管、陽性對照管、陰性對照管同時在 366nm 紫外燈下觀察,陽性對照管應有較強的藍白色熒光,陰性對照管無熒光。供試品MUG管是否有熒光,應仔細觀察比較,或?qū)⒏鞴苷{(diào)
59、換位置(陰性管居中),適當傾斜試管。如陽性對照管熒光強烈,影響供試品管與陰性對照管的觀察時,亦可移去陽性對照管。10.5 藥品中污染的大腸埃希菌,易受生產(chǎn)工藝及藥物的影響。在曙紅亞甲藍瓊脂或 麥康凱瓊脂平板上的菌落形態(tài)特征時有變化,挑取可疑菌落往往憑經(jīng)驗,主觀性較大, 務必挑選個以上菌落分別做 IMViC 試驗鑒別,挑選菌落越多,檢出陽性菌的機率越高, 如僅挑選一個菌落做 IMViC 試驗鑒別,則易漏檢。微生物限度檢查法標準操作規(guī)程文件編號:QC-FF-0039版本號:00第17頁共 28 頁文件編號:QC-FF-0039版本號:00第18頁共 28 頁10.6 在 IMViC 試驗中,以滅菌
60、接種針沾取菌苔,首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上, 然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。切勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽 瓊脂斜面上,以免產(chǎn)生假陽性結(jié)果。枸櫞酸鹽利用試驗培養(yǎng)時間,原訂為 2 天,根據(jù)試 驗資料,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng) 3 天后,枸櫞酸鹽利用試驗產(chǎn)生陽性。僅培養(yǎng) 2 天是不夠的,故試驗 培養(yǎng)時間改為 2-4天。10.7 以 IMViC 試驗來判斷大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌是含混的,有可能把埃希 菌屬的其他種判為大腸埃希菌。IMViC 試驗為+-者,除大腸埃希菌外,還有非活躍大 腸埃希菌、弗格森埃希菌、赫爾曼埃希菌。IMViC 試驗為-+-者,除大腸埃希菌外,還 有非活躍大腸埃希菌、傷口埃
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