缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織水通道蛋白9實驗研究表達(dá)

1、缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織水通道蛋白9實驗研究表達(dá)        【摘要】  目的 研究缺氧缺血性腦損傷(HIBD)后水通道蛋白9(AQP9)在腦組織中的表達(dá)變化,初步探討AQP9與腦水腫的關(guān)系。方法 采用HIBD動物模型,實施定量PCR(基因水平)和WesterBlot(免疫印跡)方法,檢測AQP9表達(dá)的變化和AQP9 mRNA的變化。結(jié)果 HIBD組AQP9的表達(dá)隨缺血時間延長而表達(dá)增加，對照組AQP9表達(dá)無明顯變化,且AQP9表達(dá)在腦缺血23 d表達(dá)最強(qiáng)。結(jié)論 HIBD時,隨著缺氧缺血時間的延長

2、,AQP9表達(dá)增強(qiáng),至72 h達(dá)高峰。 【關(guān)鍵詞】  腦損傷/病; 腦缺血; 腦缺氧; 腦水腫; 水通道蛋白9; 大鼠; 動物，實驗【Abstract】 Objective To study the change pattern of AQP9 expression in the brain tissues after hypoxicischemic brain damage and to discuss its relationship with brain edema.Methods HIBD animal model was established，and quantitati

3、ve PCR and WesternBlot were used to determine the changes of AQP9 expression and AQP9 mRNA.Results AQP9 expression had no obvious change in the control group，but in the HIBD group,AQP9 expression increased with the lasting time of ischemia,and it reached its highest level on the second and third day

4、 of ischemia.Conclusions In hypoxicischemic brain damage,AQP9 expression increases with the lasting time of hypoxia and ischemia,and it reaches its highest level at 72 hours.【Key words】 Brain damage/pathology; Cerebral ischemia; Cerebral hypoxia; Cerebral edema; AQP9; Rats; Animal，experiment缺氧缺血性腦損傷

5、(HIBD)后,大腦組織將發(fā)生一系列的病理生理變化。其中能量代謝變化和水電解質(zhì)平衡的紊亂始終貫穿于HIBD。研究表明,水通道蛋白9(aquaporin9,AQP9)與大腦的能量代謝和水電解質(zhì)平衡密切相關(guān)1。因此研究HIBD后AQP9的表達(dá),探索其在HIBD不同時間段的變化規(guī)律,有望能為進(jìn)一步闡明HIBD后腦水腫的病理生理機(jī)制提供實驗依據(jù),并為臨床提供新思路。本文通過對新生鼠HIBD模型AQP9與腦水腫關(guān)系的研究旨在為今后治療腦水腫開辟新的途徑。1 材料和方法1.1 實驗動物 200906/08取健康7日齡SD新生大鼠共40只，體質(zhì)量在1218 g,雌雄不限,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院動物中心提供

6、(動物合格證號：黑動字DT00102008)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和HIBD模型組各20只。所有動物均按照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南,動物飼養(yǎng)在實驗室,室溫穩(wěn)定在20 ,12 h明暗交替。1.2 標(biāo)本取材實驗材料及設(shè)備 外科手術(shù)器械一套，操作臺，綁鼠板，無影燈，臺燈(60 W白熾燈),顯微鏡,氮氧混合氣(其中含92% N2,8% O2),自制缺氧箱,測氧儀。1.3 主要儀器及試劑 AQP9抗體:sc20812,santa cruz(北京中山生物有限公司)，RNA提取:Trizol(上海生物技術(shù)公司)，組織蛋白PIERCE:TPER(78510)MemPER(89826)。MMLV逆轉(zhuǎn)錄試

7、劑盒:Promega Cat#A3500(100個反應(yīng))。AQP9引物上游序列:5TTG GAC CAT CAT AGG CGC3,下游序列:5GCA TGT GAT CGA CAT TGA CC3,擴(kuò)增片段長698 bp,TRIZOL Reagent(美國Invitrogen公司)，0.2 mL PCR管,0.5、1.5 mL離心管,10、200、1 000 L吸頭(美國Axygen公司)3 mL勻漿器，氯仿(三氯甲烷)，異丙醇,75%無水乙醇(DEPC水配制)。核酸蛋白檢測儀(德國Eppendorf公司)，Himac CF16RX低溫冷凍高速離心機(jī)(日本HITACHI公司)，Gilson和

8、Dragon微量加樣槍0.21 000 L,熒光定量PCR儀LightCycler 2.0(德國Roche公司)，超純水系統(tǒng)(Sartofus公司,德國)，垂直電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(BioRad公司,美國)，恒溫循環(huán)水浴箱，天平(Sartorius公司,德國)，F(xiàn)orma -80 低溫冰箱(Forma公司,美國)，西門子-20 冰箱(sietnens公司,德國),Eppendorf5415D微型離心機(jī)(Eppendorf公司,德國)，Vortex2振蕩器(sI公司,美國)。1.4 實驗方法1.4.1 HIBD動物模型的建立 新生鼠乙醚吸入作為基礎(chǔ)麻醉,消毒皮膚,2%鹽酸普魯卡因頸部局部麻醉;切開皮膚

9、及皮下組織,分離左側(cè)頸總動脈,并用70號滅菌絲線雙線結(jié)扎;置鼠于常氧空氣中30 min后,放進(jìn)含8% O2和92% N2混合氣體的低氧艙,流量為2 L/min,處理3 h,環(huán)境溫度為34 ,濕度為85%，低氧處理結(jié)束后的新生鼠放回含常氧的母鼠籠中飼養(yǎng)1 h,模型建成;對照組僅行假手術(shù),不予頸總動脈結(jié)扎和缺氧。兩組均于HIBD模型制成后6、24、48、72 h分別處死動物(各時間點(diǎn)動物5只),斷頭取新生鼠左腦，置于液氮中保存。1.4.2 RTPCR分析(實時定量PCR)1.4.2.1 總RNA的提取 應(yīng)用Invitrogen公司Trizol總RNA提取試劑,按說明書提供的方法分別提取細(xì)胞總RNA

10、。1.4.2.2 cDNA第一鏈的合成 配置RT Mix，取上述cDNA為模版進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。1.4.3 WesternBlot1.4.3.1 蛋白質(zhì)提取 將轉(zhuǎn)染48 h的組織細(xì)胞取出,用預(yù)冷的PBS沖洗3次,以洗凈細(xì)胞表面上沾有的血清中的蛋白成分;加入裂解液,將細(xì)胞從平皿上消化下來,轉(zhuǎn)入1.5 mL無菌管中(冰上操作);劇烈震蕩30 s,搖動30 min,13 000 r/min離心15 min,均在4 進(jìn)行;取上清至新的1.5 mL無菌管中,作好標(biāo)記。1.4.3.2 電泳 預(yù)先制備好12% SDSPAGE膠(SDS變性膠蛋白電泳)，將待測樣品加入4×上樣緩沖液,混勻,加熱煮沸

11、5 min;立即放于冰上,待完全冷卻后上樣，70 V恒壓電泳約6 h。1.4.3.3 Western blot分析(免役印記) 轉(zhuǎn)膜:剪切1張與凝膠大小一致的PVDF膜，兩張四邊略小于凝膠的Whatman 3號定性濾紙,作好標(biāo)記后,將其浸泡于去離子水中,待完全濕透后,浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中30 min;然后,按一定順序?qū)⑵浒卜庞跐褶D(zhuǎn)裝置中,順序為:陽極、1張Whatman 3號定性濾紙、PVDF膜、凝膠、1張Whatman 3號定性濾紙、陰極,加入適量轉(zhuǎn)移緩沖液,250 mA恒壓轉(zhuǎn)移1 h。封閉:轉(zhuǎn)移結(jié)束后,將已作好標(biāo)記的PVDF膜放入雜交盒中,用0.1% TBST液洗膜20 min,然后加入5%脫

12、脂奶粉的TBST液,室溫封閉1 h。雜交:用TBST液洗膜3次,第一次10 min,后兩次5 min/次,其間更換洗膜液;加入稀釋的一抗,4 雜交過夜;TBST液洗膜3次,10 min/次,加入稀釋的HRP標(biāo)記的二抗,室溫下雜交1 h,再用TBST液洗膜3次,10 min/次。1         ECL試劑盒檢測:將雜交后的膜淋干殘液,置于一塊干凈的保鮮膜上,蛋白面向上;將按比例混和好的ECL A/B液加到膜面上,使其在膜表面均勻鋪展,室溫避光顯色1 min;然后,用保鮮膜包好雜交膜,排出氣泡,將蛋白面向上放入暗盒

13、中,在暗室中壓片、自顯影、洗片?？贵w的再雜交:將膜放入TBST液中,室溫洗膜20 min,將其浸入55 預(yù)熱的Strip buffer中30 min;隨后用TBST液室溫洗膜30 min,5%脫脂奶粉的TBST液,封閉1 h;加入一抗室溫雜交1 h,TBST液洗膜3次,10 min/次;加入稀釋的HRP標(biāo)記的二抗,室溫下雜交1 h,再用TBST液洗膜3次，ECL檢測同上。1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，進(jìn)行兩樣本均數(shù)比較的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 RTPCR結(jié)果 見表1。表1 不同時間點(diǎn)缺血缺氧腦組織中AQP9基因RTPCR表

14、達(dá)變化(±s，n=20)注：與對照組比較，aP<0.05;與6 h比較，bP<0.05。不同時間點(diǎn)腦組織AQP9基因水平，對照組與HIBD組相比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示腦組織AQP9基因水平表達(dá)在缺氧缺血6 h后就開始升高,2448 h逐漸升高,表達(dá)加快,隨后上升至72 h達(dá)到高峰。在腦組織中AQP9蛋白表達(dá)與腦含水量的變化呈正相關(guān)。2.2 Western blot結(jié)果 見表2。表2 不同時間缺血缺氧腦組織中AQP9蛋白Western blot結(jié)果(±s，n=20)注：與對照組比較，aP<0.05;與6 h比較，bP<0.0

15、1。不同時間點(diǎn)對照組與HIBD組相比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示腦組織AQP9蛋白水平表達(dá)在缺氧缺血6 h后就開始升高,2448 h逐漸升高,表達(dá)加快,隨后上升至72 h達(dá)到高峰,并高于對照組。3 討論AQP是一種水通道,能增加膜對水的通透性,目前發(fā)現(xiàn)水通道蛋白AQP9在腦組織中分布廣泛,含量豐富,可能參與了腦組織水的運(yùn)輸平衡調(diào)節(jié)。以往動物實驗證明,在缺氧缺血性腦水腫過程中,水通道蛋白9的表達(dá)上調(diào)可能是其中一個重要環(huán)節(jié),這種發(fā)現(xiàn)可能將為缺氧缺血性腦水腫新的臨床方案提供有利的理論依據(jù)，對揭示缺氧缺血性腦水腫的發(fā)病機(jī)制意義重大。隨著研究的不斷深入,AQP9在缺氧缺血性腦水腫形

16、成中的作用引起人們廣泛關(guān)注。Elkjaer等2通過阻塞鼠大腦中動脈進(jìn)行缺血再灌注的研究發(fā)現(xiàn),再灌注后梗死灶周圍星膠質(zhì)細(xì)胞AQP9的免疫標(biāo)記,明顯增強(qiáng),在實驗性腦創(chuàng)傷性損傷后,AQP9在損傷側(cè)的表達(dá)上調(diào),而且與腦水腫的嚴(yán)重程度正相關(guān)3。以上研究提示AQP9的過度表達(dá)與腦水腫的形成密切相關(guān),但對其缺氧缺血性腦水腫發(fā)生過程中變化及與腦水腫病理變化的關(guān)系,尚缺乏系統(tǒng)的研究。本研究通過新生鼠試驗,建立新生鼠腦缺氧缺血性腦水腫模型,來研究AQP9的表達(dá)規(guī)律,研究結(jié)果顯示:AQP9在缺氧缺血性腦水腫形成中表達(dá)為動態(tài)變化過程,腦缺血6 h后AQP9 mRNA和蛋白質(zhì)開始升高,AQP9 mRNA由15.49上升

17、到16.00,AQP9蛋白值由0.821上升到0.923,隨著缺血時間延長,AQP9 mRNA和AQP9蛋白的表達(dá)同時增加,2448 h AQP9 mRNA表達(dá)明顯加強(qiáng),其上升趨勢持續(xù)到72 h達(dá)到高峰AQP9 mRNA值為16.83,與此同時,AQP9蛋白上升到1.315,在缺氧缺血性腦水腫發(fā)展過程中,AQP9 mRNA和AQP9蛋白的表達(dá)呈正相關(guān),在大腦中動脈閉塞所致缺血性腦水腫模型中,研究顯示在第3天,位于皮質(zhì)梗死周圍的分子層和外顆粒層可見AQP9 mRNA表達(dá)增強(qiáng)4,本實驗結(jié)果在第3、7天AQP9 mRNA明顯增強(qiáng)以后逐漸回落,持續(xù)7 d仍比較高,此期正是細(xì)胞水腫占主導(dǎo)地位的病理階段,

18、這與Badaut等實驗中觀察到的結(jié)果基本一致:研究發(fā)現(xiàn)梗死灶周圍,主要是皮質(zhì)、蒼白球、杏仁核的星形膠質(zhì)細(xì)胞上AQP9免疫標(biāo)記增強(qiáng),被證實可以清除細(xì)胞外大量乳酸和尿素5,在實驗性腦創(chuàng)傷損傷后,可導(dǎo)致細(xì)胞能量產(chǎn)生障礙,AQP9在損傷側(cè)表達(dá)增強(qiáng),而且與腦水腫嚴(yán)重程度呈正相關(guān),進(jìn)一步證實了AQP9表達(dá)增強(qiáng)是形成腦細(xì)胞水腫的關(guān)鍵因素,說明腦缺氧缺血性腦水腫的發(fā)生發(fā)展與AQP9的過度表達(dá)有密切關(guān)系6,而且AQP9表達(dá)與腦缺氧缺血程度呈正相關(guān)。以往研究證實,AQP9在生理條件下,可協(xié)助清除體內(nèi)乳酸鹽,并可通過“乳酸穿梭”機(jī)制將乳酸從星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元傳遞,作為神經(jīng)元能量代謝的補(bǔ)充物質(zhì),當(dāng)pH值降低到5.5

19、時,AQP9對乳酸鹽的通透性可提高4倍,同時伴隨著水分子的大量轉(zhuǎn)運(yùn),由此推測腦缺血引起乳酸酸中毒可能導(dǎo)致AQP9表達(dá)異常上調(diào),促進(jìn)腦水腫的發(fā)生發(fā)展7。研究結(jié)果提示AQP9表達(dá)增強(qiáng)可能是腦水腫產(chǎn)生的分子機(jī)制之一,由此推測缺氧缺血性腦水腫發(fā)生機(jī)制可能為:腦缺氧缺血所致Na+K+ATP酶活性下降,使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡,激活了細(xì)胞膜外的滲透壓感受器,導(dǎo)致了AQP9基因表達(dá)增強(qiáng),細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,增加了細(xì)胞膜對水的通透性,導(dǎo)致水通道開放,大量水分子和Na+離子流入細(xì)胞內(nèi),形成細(xì)胞內(nèi)水腫,同時K+離子外流增加,致使神經(jīng)細(xì)胞膜去極化,鈣通道開放,大量鈣離子流入細(xì)胞內(nèi),引起鈣超載,激活相應(yīng)的受體,使神經(jīng)細(xì)胞

20、的蛋白質(zhì)和磷脂代謝紊亂,導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒性腦水腫8。由此,可以推斷AQP9表達(dá)上調(diào)可能是缺氧缺血性腦水腫病理損傷的重要分子機(jī)制之一。因此,如能在腦水腫形成早期及時改善腦組織血氧供應(yīng),控制AQP9過度表達(dá),將有利于減輕腦水腫程度,在基因水平上通過抑制AQP9的表達(dá)可能為缺氧缺血性腦水腫提供新的治療方法,成為治療腦水腫的新突破?！尽?#160; 1 劉輝,孫善全，楊美，等.大鼠輕度腦外傷后水通道蛋白9在大腦皮質(zhì)及海馬的表達(dá)變化J.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2008,30(3):220222.2 Elkjaer M,Vajda Z,Nejsum LN,et al.Immunolocalization of AQP9 in liver，epididymis，testis，spleen，and brainJ.