糖皮質(zhì)激素在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎中對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用(1)

1、    糖皮質(zhì)激素在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎中對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用(1)    】 目的：研究糖皮質(zhì)激素在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）治療中對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的調(diào)變作用. 方法：采用從新鮮牛脊髓中提取的髓鞘堿性蛋白(MBP)免疫誘導(dǎo)Balbc小鼠成功誘發(fā)EAE后，分組注射糖皮質(zhì)激素或者安慰劑，在采用指標(biāo)評(píng)估基礎(chǔ)上，分別采用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA方法檢測(cè)CD4 CD25 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性FOXP3和血中IL10的表達(dá)水平. 結(jié)果：與對(duì)照組相比，糖皮質(zhì)激素注射組小鼠發(fā)病程度輕，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性FOXP3和血中IL

2、10的表達(dá)水平均有明顯差異. 結(jié)論：糖皮質(zhì)激素可能通過(guò)增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量及活性，減輕EAE的癥狀，為臨床治療多發(fā)性硬化(MS)提供理論基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】 糖皮質(zhì)激素; 腦脊髓炎,自身免疫性,實(shí)驗(yàn)性; T細(xì)胞; FOXP3; IL100引言多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的、以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)的自身免疫性疾病1. 糖皮質(zhì)激素可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)免疫功能，是目前治療MS 急性復(fù)發(fā)期的首選藥物2. 在動(dòng)物模型中，實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是一

3、種由Th細(xì)胞介導(dǎo)的局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)型自身免疫性疾病，被認(rèn)為是人類(lèi)MS公認(rèn)的理想動(dòng)物模型3. 本實(shí)驗(yàn)我們用從牛脊髓中提取出的髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)，同時(shí)注射百日咳桿菌菌液，誘發(fā)Balbc小鼠產(chǎn)生EAE后，輔以糖皮質(zhì)激素治療，檢測(cè)CD4 CD25 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性FOXP3和血中IL10的表達(dá)水平.1材料和方法11材料Balbc雌性小鼠30只，68 wk齡，體質(zhì)量1720 g, 購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心. 百日咳桿菌菌液購(gòu)自成都生物制品研究所. 福氏完全佐劑（FCA）及其他未聲明試劑皆購(gòu)自Sigma公司，氫化可的松(hydroeo

4、rtisone，HC)濃度為5 g/L，由天津金耀氨基酸有限公司提供. 檢測(cè)鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的Mouse Treg FlowTM試劑盒購(gòu)自Biolegend公司，IL10 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D System公司.1.2方法1.2.1MBP的提取及定量MBP的提取參照文獻(xiàn)4：將獲得的新鮮牛脊髓去除雜質(zhì)洗凈后, 將200 mL預(yù)冷的氯仿甲醇(21)混和液與100 g牛脊髓用高速組織勻漿機(jī)制成組織勻漿. 將勻漿倒入燒杯中. 加入800 mL預(yù)冷的氯仿甲醇(21)混和液，置于4冰箱磁力攪拌過(guò)夜. 將磁力攪拌后的勻漿進(jìn)行真空抽濾后得到的濾渣重新加入1000 mL氯仿甲醇混和液，磁力攪拌過(guò)

5、夜. 同法操作6次. 取濾渣用300 mL消毒純水溶解，調(diào)pH至3.0. 置于4冰箱中，磁力攪拌4 h， 12 000 rmin離心1 h. 將上清液裝入透析袋，放入消毒純水透析過(guò)夜. 將透析袋用PEG20000濃縮3.5 h，分裝，置于-70備用. 取少量濃縮液適量稀釋后，紫外分光光度計(jì)上測(cè)定A260和A280，計(jì)算出濃縮液中的蛋白質(zhì)濃度. 蛋白質(zhì)濃度(g/L)=(1.45 A280-0.74 A260)×稀釋倍數(shù).1.2.2EAE的誘導(dǎo)及發(fā)病動(dòng)物的評(píng)估按照每只小鼠注射MBPFCA (11)混和液0.4 mL，百日咳桿菌菌液PBS混合液(150) 0.2 mL. 免疫時(shí)間：第1,

6、7日共免疫2次. 對(duì)照組的小鼠不注射抗原物質(zhì). 根據(jù)Kono等5的分級(jí)方法將小鼠的癥狀分為6級(jí)，具體為：0級(jí)（沒(méi)有任何臨床癥狀）；1級(jí)（動(dòng)物尾部無(wú)力）；2級(jí)（動(dòng)物尾部無(wú)力 前肢或后肢中等無(wú)力）；3級(jí)（前肢或后肢嚴(yán)重?zé)o力，人為翻身后不能恢復(fù)）；4級(jí)（肢體麻痹，人為翻身后不能恢復(fù)）；5級(jí)（瀕死狀態(tài)）.1.2.3Balb/c小鼠EAE的糖皮質(zhì)激素注射及外周血采集將Balb/c小鼠分為EAE誘導(dǎo)組、 EAE誘導(dǎo)同時(shí)肌肉注射生理鹽水組和EAE誘導(dǎo)同時(shí)肌肉注射HC組，每組10只. EAE誘導(dǎo)同時(shí)肌肉注射HC組按照每只小鼠每日注射0.1 mL HC連續(xù)7 d或者到病情緩解. 7 d后每組各取5只小鼠心臟血液

7、，抗凝存放. 其余5只進(jìn)行發(fā)病評(píng)估.1.2.4鼠外周血IL10及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)將抗凝血稍靜置，取上層血漿, 按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)外周血IL10含量，余下血細(xì)胞用生理鹽水混勻后，以小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒Mouse Treg FlowTM測(cè)定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用x±s表示,采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行方差分析及LSDt檢驗(yàn),以P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1小鼠指征評(píng)估與文獻(xiàn)4描述類(lèi)似，Blab/c小鼠在MBP等免疫條件下，最早第3日出現(xiàn)尾部無(wú)力、后肢稍外展的臨床癥狀；第1015日，癥狀達(dá)到高峰，出現(xiàn)質(zhì)量減輕、行動(dòng)非常緩慢

8、、推之不動(dòng)、弓背、尾部無(wú)力、后肢無(wú)力、明顯外展、癱瘓等癥狀，最高臨床分級(jí)達(dá)4級(jí)；第21日開(kāi)始，癥狀緩解，第30日基本恢復(fù)正常. 但是在糖皮質(zhì)激素治療組，最早第10日開(kāi)始時(shí)，才出現(xiàn)輕微的尾部無(wú)力、后肢稍外展的1到2級(jí)臨床癥狀，第1315日，癥狀達(dá)到高峰，出現(xiàn)質(zhì)量減輕等癥狀，最高臨床分級(jí)達(dá)到3級(jí)，病情較快緩解，到第19日基本恢復(fù)正常.    2.2小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)在糖皮質(zhì)激素治療組，CD4 CD25 和FOXP3 的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平明顯高于對(duì)照組(15.8 ±3.2)% vs (2.4±1.6)%, P<0.05, n=5和未

9、治療組 (15.8 ±3.2)% vs (2.9±1.5)%, P<0.05, n=5, 對(duì)照組和未治療組間沒(méi)有明顯差別(2.4±1.6)% vs (2.9±1.5), P>0.05, n=5 (圖1).            【關(guān)鍵詞】糖皮質(zhì)激素;,腦脊髓炎,自身免疫性,實(shí)驗(yàn)性;,T細(xì)胞;,FOXP3;,ILEffect of glucocorticoid on CD4 CD25   

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11、5, 對(duì)照組和未治療組間沒(méi)有明顯差別(18.6±5.6) ng/L vs (20.4±6.3) ng/L, P>0.05, n=5.3討論MS是T細(xì)胞介導(dǎo)的CNS脫髓鞘疾病，已致敏的T淋巴細(xì)胞通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi),在抗原呈遞細(xì)胞作用下再次活化6. 以往發(fā)現(xiàn)，MS發(fā)病時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS內(nèi)最重的抗原呈遞細(xì)胞,對(duì)激活T細(xì)胞具重作用7. 對(duì)于針對(duì)MS或者EAE糖皮質(zhì)激素治療的T淋巴細(xì)胞的研究中，往往著重于效應(yīng)細(xì)胞，如CD4 Th1/Th2細(xì)胞，或者CD8 的殺傷性T細(xì)胞，但是對(duì)于這幾年的研究熱點(diǎn)CD4 CD25 FOXP3 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在糖皮質(zhì)激素治療下的調(diào)變，迄今未見(jiàn)

12、文獻(xiàn)報(bào)道.李茂全等8發(fā)現(xiàn)，在體外利用小膠質(zhì)細(xì)胞系N9模型模擬EAE糖皮質(zhì)激素治療后，N9表面的抗原遞呈分子MHC II和共刺激分子OX40L表達(dá)都顯著下調(diào). T細(xì)胞活化的雙信號(hào)學(xué)說(shuō)指出, 抗原呈遞細(xì)胞將抗原處理成肽段與MHC 結(jié)合形成復(fù)合物提供T細(xì)胞活化所需的第一信號(hào),而抗原呈遞細(xì)胞與T細(xì)胞表面的共刺激分子相互作用提供第二信號(hào)9. OX40及其配體OX40L是近年發(fā)現(xiàn)的一對(duì)共刺激分子, 研究證實(shí)OX40/OX40L的作用為抗原呈遞細(xì)胞維持活化后T 淋巴細(xì)胞功能所必需10. 與此同時(shí)，Ito等11發(fā)現(xiàn)OX40L分子能夠從誘發(fā)階段到效應(yīng)階段以及記憶性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能喪失. 所以我們考慮是否在EA

13、E模型中，糖皮質(zhì)激素一方面通過(guò)削弱小膠質(zhì)細(xì)胞的APC功能，減低特異性T細(xì)胞殺傷效應(yīng)；另一方面減弱OX40L的表達(dá)，從而減弱對(duì)局部調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的“失能”效應(yīng). 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素作用后，小鼠的EAE無(wú)論從發(fā)病的時(shí)間還是周期都明顯改善，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量與單純MBP免疫組和對(duì)照治療組比較都有明顯增加. 對(duì)應(yīng)地，反映調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的IL10分泌水平也明顯增加. IL10也是抑制CD4 和CD8 T細(xì)胞的重細(xì)胞因子12.糖皮質(zhì)激素對(duì)整個(gè)免疫過(guò)程的調(diào)節(jié)是多角度和多層次的13，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論在一定基礎(chǔ)上解釋了臨床上激素治療對(duì)MS的緩解的原因. 由于小鼠的EAE模型和人類(lèi)的MS有一定差距，基于

14、臨床患者中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究需進(jìn)一步進(jìn)行.【參考文獻(xiàn)】1 Hafler DA, Slavik JM, Anderson DE, et al. Multiple sclerosisJ. Immunol Rev, 2005, 204:208-231.2 Rizvi SA, Bashir K. Other therapy options and future strategies for treating patients with multiple lerosisJ. Neurology, 2004, 63(12 Suppl 6): S47-S54.3 Skundric DS. Experimen

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