阿糖胞苷上調(diào)白血病細(xì)胞CD86分子及細(xì)胞因子表達(dá)的研究

1、阿糖胞苷上調(diào)白血病細(xì)胞CD86分子及細(xì)胞因子表達(dá)的研究         11-01-31 09:18:00     編輯：studa20          作者：范冬梅, 楊銘, 賈海榮, 高瀛岱, 王金宏, 紀(jì)慶, 熊冬生, 楊純正【摘要】  目的: 觀察阿糖胞苷（AraC）對(duì)急性白血病細(xì)胞CD86分子表達(dá)的影響, 并探討其作用機(jī)制。方法: 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)U937、

2、 HL60、 NB4細(xì)胞經(jīng)AraC處理前后CD86分子表達(dá)變化, RTPCR檢測(cè)AraC對(duì)各組細(xì)胞 CD86 mRNA、 NFB以及細(xì)胞因子IFN的表達(dá)變化。結(jié)果: 經(jīng)AraC處理的急性白血病細(xì)胞CD86分子表達(dá)與對(duì)照組相比均明顯升高（P<0.05）; CD86 mRNA表達(dá)水平也明顯增強(qiáng); AraC處理后細(xì)胞核內(nèi)NFB表達(dá)明顯上調(diào); 并且IFN mRNA在T細(xì)胞活化72 h可檢測(cè)到。結(jié)論: AraC能使U937、 HL60、 NB4急性白血病細(xì)胞CD86表達(dá)增加, 有利于NFB等轉(zhuǎn)錄因子活化, 促進(jìn)CD86轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)、 表達(dá)增加并可有效地增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性, 激活T細(xì)胞, B72在T

3、細(xì)胞活化中起著更重要的作用。 【關(guān)鍵詞】  阿糖胞苷 NF B CD86 T細(xì)胞 細(xì)胞因子Abstract  AIM: To observe the effects of Arac on the expression of CD86 molecule on acute leukemia cells and explore the possible mechanisms. METHODS: The expression of CD86 on U937,  HL60 and NB4 cell lines treated with or without AraC

4、0; wa assayed by flow cytometry. The mRNA expression of CD86, NFB, IFN was examined by semiquantitative RTPCR. RESULTS: UPregulation of CD86 was observed on those cells treated by Arac. The leve of CD86 and NFB mRNA in Arac treated cells was significantly  enhanced. IFN was detectable 72 hours

5、after  T cell activation. CONCLUSION: AraC can enhance CD86 and NFB expression on acute leukemia cells,  which may play  critical role in T cell activation and differentiation.KeywordsArac; NFB; CD86; T cell; cytokine在腫瘤免疫反應(yīng)中, 腫瘤細(xì)胞即使表達(dá)高水平的MHC和類(lèi)抗原并存在特異性的腫瘤肽, 在缺乏適宜的共刺激信號(hào)時(shí)也不能有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和增

6、殖1 。共刺激信號(hào)不是抗原特異性的, 亦不受MHC限制 。 B7/CD28共刺激信號(hào)與第1信號(hào)協(xié)同, 能上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá), IL2 mRNA轉(zhuǎn)錄增加, 使T細(xì)胞從細(xì)胞周期的G0期進(jìn)入G1期, 有助于T細(xì)胞大量增殖。在T細(xì)胞膜上有多種共刺激分子與第2信號(hào)產(chǎn)生有關(guān), 例如 LFA1、 VLA4及CD28等, 其中以CD28分子最重要。這條信號(hào)通路的作用已在鼠模型中顯示, 它證實(shí)了B7CD28/CTLA4在自身免疫性疾病, 腫瘤免疫和同種異體排斥反應(yīng)中的重要作用。B7家族分子（包括B71和B72等）是激發(fā)免疫應(yīng)答的重要協(xié)同刺激分子。B72也稱(chēng)CD86, 相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為50000的跨膜糖蛋白

7、, 基因定位于3q21, 屬免疫球蛋白超家族(IGSF)成員之一, 主要表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞(APC)上2, 3 。B72既參與T細(xì)胞的活化,免疫應(yīng)答的維持與調(diào)節(jié)4, 同時(shí)也參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答5。本實(shí)驗(yàn)中選用不表達(dá)或低表達(dá)B72分子的急性白血病細(xì)胞作為研究對(duì)象, 體外觀察經(jīng)AraC刺激后B72的表達(dá), CD86的上調(diào)與核轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系, 以及在對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫中的作用, 為進(jìn)一步研究急性白血病的發(fā)病機(jī)制及免疫治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1  材料和方法1.1  材料  阿糖胞苷（Cytarabine, AraC）購(gòu)自法瑪西亞公司。小鼠抗人 CD86/PE 標(biāo)

8、記抗體、 小鼠 IgG1 PE標(biāo)記抗體, 均購(gòu)自晶美生物工程有限公司。胎牛血清購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所科技公司。TRIzol reagen總RNA提取試劑盒、 RPMI1640培養(yǎng)干粉為Invitrogen公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BectonDikinson公司產(chǎn)品。1.2  方法1.2.1  細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)  U937、 HL60及NB4細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含100 mL/L的滅活胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中, 置于50 mL/L CO2, 飽和濕度的37培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 隔天傳代培養(yǎng), 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.2.2  流式細(xì)胞術(shù)(FC

9、M)檢測(cè)CD86的表達(dá)  收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937、 HL60和NB4細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L, 加入終濃度為0.25 mol/L的AraC作用72 h, 對(duì)照組加入等體積的PBS。收集細(xì)胞, 用PBS洗2次, 分別加入PE標(biāo)記的CD86抗體, PBS洗2次。CD86同型對(duì)照為Mouse IgG1 PE標(biāo)記抗體, 用FCM檢測(cè)6。激發(fā)光為氬離子激光488 nm, 每個(gè)樣品測(cè)定10000個(gè)活細(xì)胞數(shù)。其結(jié)果用CELL Quest軟件分析。1.2.3  RTPCR測(cè)定CD86 mRNA的表達(dá)  取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937、 HL60、 NB4細(xì)胞, 調(diào)

10、整細(xì)胞密度,  分別加入終濃度為 0.25 mol/L的AraC作用72 h, 以未加AraC刺激的細(xì)胞作為對(duì)照組。收集細(xì)胞按照TRIzol說(shuō)明書(shū)操作步驟提取細(xì)胞總RNA, 取適量DEPC水溶解沉淀, 紫外分光光度計(jì)定量。分別各取10 g總RNA, 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 引物由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成, 擴(kuò)增條件為: 94, 40 s, 52, 30 s, 72, 1 min, 30個(gè)循環(huán), 行15 g/L agarose凝膠電泳, 擴(kuò)增產(chǎn)物為488 bp。以actin為內(nèi)對(duì)照。引物序列設(shè)計(jì)如下: CD86: 上游引物 5GGGGGATCCATGGGCAATCCTTAT3;

11、下游引物 5TCGGGTGACCTTGCTTAGACGTGCAGG3; actin: 上游引物 5CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3; 下游引物 5CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3。1.2.4  RTPCR分析核轉(zhuǎn)錄因子NFB的表達(dá)  收集經(jīng)0.25 mol/L AraC處理72 h的U937、 HL60和NB4細(xì)胞以及對(duì)照組細(xì)胞, 提取細(xì)胞的總RNA, 以actin為內(nèi)對(duì)照, 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物NFB, actin,   均由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成, PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后, 紫外透射儀分析圖象并拍照。引物序

12、列設(shè)計(jì)如下: NFB: 上游引物 5ACGATCTGTTTCCCCTCATC3; 下游引物 5TGCTTCTCTCCCCAGCAATA3。1.2.5  RTPCR檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中IFN mRNA的表達(dá)  將急性白血病細(xì)胞U937、 HL60、 NB4用終濃度為0.25 mol/L AraC刺激72 h, 作為混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中的刺激細(xì)胞, 用培養(yǎng)基洗1次, 室溫2000 r/min, 離心5 min 。臺(tái)盼藍(lán)染色, 計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù), 然后用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度1×108/L。反應(yīng)細(xì)胞的制備: 常規(guī)分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC), 用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為

13、1×1010/L, 接種于培養(yǎng)瓶中, 50 U/L白細(xì)胞介素2(IL2)培養(yǎng)3 d。收集細(xì)胞, 用培養(yǎng)液洗1次, 然后進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù), 再用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為4×109/L。將制備好的反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞, 按照一定的效靶比加入6孔培養(yǎng)板中, 設(shè)未經(jīng)處理的刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞作為對(duì)照組。于37、 50 mL/L CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集混合淋巴細(xì)胞, 提取細(xì)胞的總RNA。RT反應(yīng)合成cDNA第1鏈的體系25 L, 含有2 g總RNA, 5×AMV逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 L, 10 mmol/L dNTP2 L, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶10 U, 隨機(jī)引物1 L, 于PCR

14、儀上42反應(yīng)1 h, 95滅活5 min, 冰上冷卻5 min, 置-80保存。PCR反應(yīng)體系25 L, dNTP(10 mmol/L) 0.5 L, 10×緩沖液2 L, Taq DNA聚合酶1 U, cDNA 2 L, IFN引物各1 L, 以actin為內(nèi)參照。引物由天津厚普生物工程公司合成。反應(yīng)條件: 94預(yù)變性5 min, 94 30 s, 57 1 min, 72 2 min, 循環(huán)35次, 72延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后, 紫外光透射儀分析圖像并照相。2  結(jié)果2.1  AraC上調(diào)急性白血病細(xì)胞CD86分子表達(dá)  U937、 HL60和NB4細(xì)胞經(jīng)AraC處理72 h后CD86分子的表達(dá)較對(duì)照組均有不同程度的提高（圖1）。說(shuō)明0.25 mol/L的AraC與細(xì)胞作用72 h后能夠上調(diào)CD86分子的表達(dá)。圖1  FCM檢測(cè)0.25 mol/L AraC處理的U937、 HL60及NB4急性白血病細(xì)胞CD86分子表達(dá)結(jié)果（略）Fig 1  The expression of CD86 on ac