食管癌患者外周血CK20、CK19、CEAmRNA的表達(dá)及其臨床病理意義

1、食管癌患者外周血CK20、CK19、CEAmRNA的表達(dá)及其臨床病理意義              作者：王景美，杜艷，郭英，吳平平，金月玲，田小強(qiáng)，黃培林 【關(guān)鍵詞】  食管癌；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；CK20；CK19；癌胚抗原；微轉(zhuǎn)移摘要目的：研究89例食管癌患者外周血中CK20、CK19及CEA mRNA的表達(dá)，并探討其臨床病理意義。方法：巢式RTPCR技術(shù)檢測(cè)89例食管癌患者術(shù)前外周血中CK20、CK19、CEA mRNA的表達(dá)。結(jié)果：89例食管癌患者外周血中

2、CK20、CK19及CEA的陽(yáng)性表達(dá)率分別為49.44%、34.83%及52.81%；三基因同時(shí)檢測(cè)時(shí)，至少1個(gè)基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的表達(dá)率為71.91，與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。結(jié)論：CK20、CEA可作為檢測(cè)食管癌患者外周血微轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志，RTPCR聯(lián)合檢測(cè)多種標(biāo)志物可為了解腫瘤的惡性生物學(xué)行為、指導(dǎo)臨床治療方案的選擇、判斷預(yù)后及監(jiān)測(cè)療效提供依據(jù)。   關(guān)鍵詞食管癌；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；CK20；CK19；癌胚抗原；微轉(zhuǎn)移   我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，食管癌的死亡率僅次于胃癌。近年來(lái)盡管手術(shù)切除率不斷提高，但患者死亡率

3、仍居高不下，其原因?yàn)槟[瘤的高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移率。研究表明，惡性腫瘤在侵襲和轉(zhuǎn)移的早期階段就可能有癌細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，而患者常無(wú)任何臨床表現(xiàn)，普通檢測(cè)手段亦不能發(fā)現(xiàn)，即腫瘤微轉(zhuǎn)移（micrometastasis）。若能及時(shí)檢測(cè)循環(huán)血中的癌細(xì)胞，將對(duì)判斷腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及指導(dǎo)臨床治療具有重要的價(jià)值。本研究應(yīng)用巢式RTPCR技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)89例食管癌患者外周血中組織特異性標(biāo)志物CK20、CK19、CEA mRNA的表達(dá)，并探討其臨床病理意義。   1  資料和方法   1.1  一般資料隨機(jī)選擇東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院和南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院200

4、0年12月到2004年9月外科收治的食管癌患者89例，所有病例經(jīng)術(shù)前病理確診且尚未化療，術(shù)前抽取外周血。另隨機(jī)收集22名健康捐獻(xiàn)者及27例非腫瘤患者（其中反流性食管炎患者14例、腐蝕性食管灼傷患者2例、賁門(mén)失弛緩癥患者9例、食管憩室患者2例）外周血為陰性對(duì)照。15例食管癌腫瘤組織為陽(yáng)性對(duì)照。食管癌患者組平均年齡62.6歲（3683歲），中位年齡65歲，男性62例，女性27例。陰性對(duì)照組平均年齡40.8歲（2471歲），男性30人，女性19人。收集食管癌患者臨床病理資料，參照UICC(2002)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TMN分期。   1.2  試劑及引物淋巴細(xì)胞分離液、DEPC購(gòu)

5、自上海生工生物工程技術(shù)公司；Trizol Reagent為加拿大Sangon公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒及Taq酶等為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)，由上海申友生物公司合成，見(jiàn)表1。   1.3  方法   1.3.1  樣本處理及RNA提取  采集患者術(shù)前外周靜脈血35ml，枸櫞酸鈉抗凝，2h內(nèi)以Ficoll淋巴細(xì)胞分離法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（the peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）。腫瘤組織以勻漿器研碎得細(xì)胞懸液。參照Trizol一步法提取細(xì)胞和組織的總RNA，無(wú)

6、RNA酶的DNase去除混雜的DNA，-80保存待用。表1  RTPCR反應(yīng)引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物   1.3.2  逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR 擴(kuò)增  取12g細(xì)胞總RNA，70 6min 變性后，根據(jù)TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 第1鏈合成。各取4l cDNA行第1輪PCR，取第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物0.5l行第2輪PCR，上、下游引物各20pmol，另有10×PCR Buffer、10mmolL-1dNTP、25mmolL-1MgCl2及Taq polymerase（0.625U）等，反應(yīng)總體積25l。   1.3

7、.3  結(jié)果判斷  取5 l第2輪PCR產(chǎn)物以1.8%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察并拍照，在303、319、131及531bp處出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)條帶判為陽(yáng)性。   1.4  統(tǒng)計(jì)分析用SPSS軟件包分析各組數(shù)據(jù)，采用2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，以P0.05為差異有顯著性。   2  結(jié)   果89例食管癌患者及49例陰性對(duì)照組的外周血單個(gè)核細(xì)胞、15例食管癌患者腫瘤組織都擴(kuò)增出了片段大小為531bp的內(nèi)參對(duì)照actin，所有標(biāo)本均進(jìn)行CK20、CK19、CEA特異性巢式RTPCR擴(kuò)

8、增，結(jié)果見(jiàn)圖1。   2.1  CK20、CK19、CEA mRNA在腫瘤組織及陰性對(duì)照組的表達(dá)15例食管癌腫瘤組織中CK20、CK19和CEAmRNA均為陽(yáng)性。22例健康捐獻(xiàn)者外周血中有3例CEA陽(yáng)性；非腫瘤患者外周血中有3例CK20陽(yáng)性（2例反流性食管炎患者，1例腐蝕性食管灼傷患者），3例CK19陽(yáng)性（腐蝕性食管灼傷、賁門(mén)失弛緩癥、食管憩室患者各1例），3例CEA陽(yáng)性（均為反流性食管炎患者）。   2.2  單基因檢測(cè)結(jié)果與臨床病理資料的相關(guān)性89例食管癌患者外周血中CK20、CK19和CEA mRNA的陽(yáng)性率分別為49.44%（

9、44/89）、34.83%（31/89）和52.81%（47/89）。各基因RTPCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表1。表1  食管癌患者外周血中各基因表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)分析表明，CK20 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率與食管癌患者的年齡、性別、細(xì)胞分化、腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，而與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P0.01)。CK19mRNA的陽(yáng)性表達(dá)與患者上述所有的臨床病理資料均無(wú)相關(guān)性(P0.05)。而CEAmRNA的陽(yáng)性表達(dá)則與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05及P0.01)。   2.3  多基因檢測(cè)結(jié)果與臨床病理資料的相關(guān)性如表2所示，本研究中，同

10、時(shí)檢測(cè)CK20、CK19及CEA三基因的任意兩基因時(shí)，至少1個(gè)基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的表達(dá)率為61.80% (55/89)66.29%(59/89)，其中CK20/CEA及CK19/CEA與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P0.01)，CK20/CK19則與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P0.05)。三基因同時(shí)檢測(cè)時(shí)，至少1個(gè)基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(CK20/CK19/CEA) 的表達(dá)率為71.91(64/89)，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P0.05)；8例三基因皆陽(yáng)性表達(dá)(CK20+CK19+CEA) 者為晚期腫瘤患者，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明其與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P0.01)?；颊叩哪挲g、性別、腫瘤的細(xì)胞分化

11、及浸潤(rùn)深度與多基因檢測(cè)結(jié)果均無(wú)相關(guān)性。表2  食管癌患者外周血多基因表達(dá)         3  討   論近20年來(lái)腫瘤微轉(zhuǎn)移已成為研究熱點(diǎn)之一。腫瘤細(xì)胞在外周血中的微轉(zhuǎn)移是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要起始步驟，腫瘤細(xì)胞彌散入淋巴結(jié)、骨髓及外周血預(yù)示著患者生存時(shí)間的縮短。播散到外周血中的實(shí)體腫瘤細(xì)胞數(shù)目非常少，需要高度敏感、特異的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，RTPCR技術(shù)具有高度的敏感性和特異性，被認(rèn)為是目前檢測(cè)外周血微轉(zhuǎn)移的有效方法。許多學(xué)者對(duì)胃腸道癌、乳腺癌、胰腺癌等的研究結(jié)果表明，外周血

12、中循環(huán)癌細(xì)胞的檢出與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有相關(guān)性，并且是影響遠(yuǎn)期生存的獨(dú)立因素，可為腫瘤病人合理治療方案的制定及預(yù)后判斷提供客觀依據(jù)。CK20、CK19、CEA是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的、最常見(jiàn)的上皮性組織特異性標(biāo)志物。細(xì)胞角蛋白（cytokeratins,CKs）是分布于上皮細(xì)胞的中間纖維，它含有20多種異構(gòu)體，其表達(dá)方式反映了上皮細(xì)胞分化的不同途徑。由于癌細(xì)胞大多保留起源細(xì)胞的CKs類(lèi)型，由此便可通過(guò)測(cè)定CKs來(lái)決定癌細(xì)胞的起源。CK19、CK20可作為檢測(cè)外周血中循環(huán)癌細(xì)胞的有效的生物標(biāo)志物，主要用于檢測(cè)胃腸道、乳腺、前列腺及肺的惡性腫瘤。CEA是一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志，幾乎所有上皮組織及其起源的腫瘤組

13、織都可檢測(cè)出CEAmRNA，而非上皮性細(xì)胞呈陰性表達(dá)。CEAmRNA陽(yáng)性主要見(jiàn)于胃腸道腫瘤及乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等。Nishida等1認(rèn)為RTPCR法檢測(cè)外周血中的循環(huán)癌細(xì)胞的CEA可能是預(yù)測(cè)胃腸道癌術(shù)后有價(jià)值的標(biāo)志物。我們對(duì)胃癌、腸癌、乳腺癌及肺癌患者術(shù)前外周血的研究也提示，CK20、CK19、CEA是檢測(cè)上皮惡性腫瘤尤其胃腸道癌外周血微轉(zhuǎn)移有潛力的生物學(xué)標(biāo)志24。目前食管癌微轉(zhuǎn)移方面的研究稍滯后于胃腸道癌。Osullivan等研究發(fā)現(xiàn)，50例食管癌患者肋骨骨髓微轉(zhuǎn)移檢出率為88%，髂骨骨髓僅為15%，并將肋骨骨髓中癌細(xì)胞成功接種于裸鼠皮下，說(shuō)明食管癌患者循環(huán)中存在癌細(xì)胞。Thorban及M

14、acadam等67的研究表明，食管癌患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的血行播散發(fā)生在腫瘤進(jìn)展的早期，骨髓中微轉(zhuǎn)移的檢出預(yù)示著術(shù)后早期的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。Natsugoe等以CEA特異性RTPCR檢測(cè)了48例食管癌患者的骨髓，研究結(jié)果提示RTPCR結(jié)果陽(yáng)性者的復(fù)發(fā)及存活率較陰性者差。Ito等的研究結(jié)果也表明，食管癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢出預(yù)示著腫瘤的早期復(fù)發(fā)。我們的研究結(jié)果表明，89例食管癌患者術(shù)前外周血中，CK20mRNA陽(yáng)性表達(dá)的有44例（49.44%），CK19mRNA陽(yáng)性表達(dá)的有31例（34.83%），CEAmRNA陽(yáng)性表達(dá)的有47例（52.81%）。結(jié)合臨床隨訪資料分析表明，CK20mRNA的陽(yáng)性表達(dá)與

15、食管癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P0.01)；CEAmRNA的陽(yáng)性表達(dá)則與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05及P0.01)；CK19mRNA的陽(yáng)性表達(dá)則與所有的臨床病理資料均無(wú)相關(guān)性(P0.05)。這些結(jié)果提示，CK20、CEA更適宜作為檢測(cè)食管癌患者外周血微轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物，術(shù)前外周血中CK20、CEAmRNA的陽(yáng)性表達(dá)與食管癌的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)可能有助于指導(dǎo)臨床治療及判斷預(yù)后，這與國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道類(lèi)似。此外，在健康捐獻(xiàn)者及非腫瘤患者外周血中也有CK20（3例）、CK19（3例）及CEA（6例）的陽(yáng)性表達(dá)，可能為上皮細(xì)胞污染（常規(guī)靜脈采血時(shí)）或者炎癥時(shí)釋放

16、的細(xì)胞因子誘導(dǎo)了血細(xì)胞中上皮性標(biāo)志物的表達(dá)所致的假陽(yáng)性，尚需增加對(duì)照組病例數(shù)以進(jìn)一步證實(shí)。統(tǒng)計(jì)分析表明，陰性對(duì)照組與食管癌患者組相比較，外周血檢測(cè)結(jié)果具有顯著性差異(P0.01)。分析多基因檢測(cè)結(jié)果與食管癌患者的臨床病理資料，結(jié)果表明，同時(shí)檢測(cè)CK20、CK19及CEA三基因的任意兩個(gè)基因時(shí)，至少1個(gè)基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的表達(dá)率為61.80% (55/89)66.29%(59/89)，三基因至少1個(gè)基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(CK20/CK19/CEA) 的表達(dá)率達(dá)71.91(64/89)。與單個(gè)基因的檢測(cè)結(jié)果相比，陽(yáng)性率都有上升，提高了檢測(cè)的敏感性。表3同時(shí)表明，聯(lián)合同時(shí)檢測(cè)多基因時(shí)，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和

17、（或）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，食管癌患者外周血中陽(yáng)性表達(dá)率有上升趨勢(shì)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8例晚期食管癌患者外周血中同時(shí)表達(dá)CK20、CK19及CEAmRNA(CK20+CK19+CEA)，17例晚期食管癌患者外周血中CK20、CK19及CEAmRNA則至少1個(gè)基因?yàn)殛?yáng)性表達(dá)(CK20/CK19/CEA)，而陽(yáng)性對(duì)照的15例食管癌腫瘤組織均為三基因陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明并非在所有已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或術(shù)后復(fù)發(fā)的患者三基因的表達(dá)水平相同，即使在同一腫瘤中并非所有標(biāo)志物的表達(dá)水平相似。單個(gè)基因檢測(cè)時(shí)，如目的基因mRNA表達(dá)量少，極有可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陰性，如能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，則可避免此種結(jié)果。而聯(lián)合多種標(biāo)志物、多時(shí)間

18、點(diǎn)檢測(cè)，更能增加結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信性，尚需多時(shí)間點(diǎn)取材以及進(jìn)一步增加病例數(shù)。本研究以RTPCR技術(shù)對(duì)89例食管癌患者外周血中CK20、CK19、CEAmRNA進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明CK20、CEAmRNA的表達(dá)與食管癌的轉(zhuǎn)移有很強(qiáng)的相關(guān)性，多基因聯(lián)合檢測(cè)可避免單基因造成的遺漏，可作為一種檢測(cè)外周血循環(huán)癌細(xì)胞的有效方法，可進(jìn)一步了解腫瘤的惡性生物學(xué)行為，有助于臨床治療方案的制定和預(yù)后評(píng)估，為指導(dǎo)制定個(gè)體化的合理綜合治療方案提供依據(jù)，并進(jìn)一步支持了我們以前的研究成果10。   參考文獻(xiàn)   1NISHIDA S,KITAMURA K,ICHIKAWA D,et

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