培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng)

1、v1.0 可編輯可修改培養(yǎng)基制備的基本方法和注意事項(xiàng)1. 培養(yǎng)基配方的選定2.3. 同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此，除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán) 格按其規(guī)定進(jìn)行配制外一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料加以比較核對再依據(jù)自己的使 用目的加以選用，記錄其來源。4.5. 2 培養(yǎng)基的制備記錄6.7. 每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)推各稱，配方及其來源和各種成份的牌號。最 終 pH 值、消毒的溫度和時(shí)間制各的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存?zhèn)?查，復(fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。8.9. 3. 培養(yǎng)基成分的稱取10.11. 培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂

2、最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴?方置于傍側(cè)，每稱完一種成分即在配方上做出記號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置 于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。12.13. 4. 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化14.15. 培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。 使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋， 以防有微量銅 或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長。最好使用不銹鋼鍋加熱溶化也可放入大燒杯或 大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動(dòng)蒸汽消毒器中蒸煮溶化。 在鍋中溶化時(shí)、 可先用溫水 加熱并隨時(shí)擾動(dòng)，以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。 待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成

3、分完全溶化迄至煮沸。如為瓊脂培 養(yǎng)基，應(yīng)先用一部分水將瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混 合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。16.17. 5.培養(yǎng)塞 pH 的初步調(diào)整18.19. 培養(yǎng)基各成分完全溶解后， 應(yīng)進(jìn)行 pH 的初步調(diào)正， 因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、 pH 會 有所變化， 例如，牛肉浸液約可降低 .而腸浸液 pH 卻會有顯著的升高。 因此，對這個(gè)步 驟，操作者應(yīng)隨時(shí)注意探索經(jīng)驗(yàn)、以期能掌握培養(yǎng)基的最終 pH ，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。v1.0 可編輯可修改pH 調(diào)正后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。20.21. 6培養(yǎng)基的過濾

4、澄清22.23. 液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀，因此，須要采用過濾或其 它澄清方法以達(dá)到此項(xiàng)要求。 一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法， 濾紙應(yīng)拆疊成折扇成漏 斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。24.25. 瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。 亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過 濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾。 如過濾法不能達(dá)到澄清要求、 則須用蛋清澄清法。 即將冷卻至 55- 60 的培養(yǎng)基放入大 的三角燒瓶內(nèi)，裝入量不得超過燒瓶容量的1/ 2 ，每 1000ml 培養(yǎng)基加入 1-2 個(gè)雞蛋的蛋白 強(qiáng)力振搖 3-5

5、分鐘， 置高壓蒸汽滅菌器中、 121加熱 20 分鐘、 取出趁熱以絨 布過濾即可。26.27. 若能自行沉淀者，亦可靜置冰箱中 1-2 日、吸取其上清液即可。28.29. 7. 培養(yǎng)基的分裝30.31. 培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得 超過容器裝盛量的 2/ 3 。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還雙用防水紙包扎 （現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。分裝 瓊脂抖面培養(yǎng)基時(shí)，分裝量應(yīng)以能形成 2 / 3 底層和 1/ 3 斜面的量為恰當(dāng)。分裝容器 應(yīng)予先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒， 以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。 每批培養(yǎng)

6、基應(yīng)另外分裝 20ml 培養(yǎng)基于一小玻瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH 之用。32.33. 8. 培養(yǎng)基的滅菌34.35. 一般培養(yǎng)基可采用 121 高壓蒸汽滅菌 15 分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如 無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。36.37. 某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成 20% 如或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒， 以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體 液和抗生素等則應(yīng)從無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50 左右的培養(yǎng)基中。v1.0 可編輯可修改38.39. 瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出、待冷至55- 60時(shí)，

7、擺置成適當(dāng)斜面、待其自然凝固。40.41. 9. 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試42.43. 每批培養(yǎng)基制備好以后應(yīng)仔細(xì)檢查一遍：如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被 培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終pH。44.45. 將全部培養(yǎng)基放入 36±1 恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。46.47. 用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種 1-2 管或瓶培養(yǎng)基， 培養(yǎng) 24- 48 小時(shí)， 如無菌生長或生長不好。 應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。48.49. 10. 培養(yǎng)基的保存50.51. 培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時(shí)間不宜超過一周，傾注的平

8、板 培養(yǎng)基不宜超過 3 天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制各記錄副頁或明顯標(biāo)簽。培養(yǎng)基的常規(guī)配制程序一、目的要求了解培養(yǎng)基的配制原理。了解培養(yǎng)基常規(guī)配制程序。了解培養(yǎng)基配制過程各環(huán)節(jié)的要求和注意事項(xiàng)。二、基本原理正確掌握培養(yǎng)基基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)， 由于微生物種類及代謝類型的多樣性， 因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多， 它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿的準(zhǔn)備， 培養(yǎng)基的配制與分裝，棉v1.0 可編輯可修改塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相向。三、實(shí)驗(yàn)材科（一）藥品 待配各種培養(yǎng)的組

9、成成分，瓊脂， 1mol/L NaOH溶液， 1mol/l （ 升，統(tǒng)一用大寫 ）HCl 溶液。（二）儀器 天平或臺秤，高壓蒸汽滅菌鍋。（三）玻璃器皿 移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。（四）其他物品藥匙、稱量紙、 pH 試紙、記號筆、棉花、紗布、線繩、塑料試管蓋、牛皮紙、報(bào)紙等。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一） 玻璃器皿的洗滌和包裝1玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將錐形瓶、 試管、培養(yǎng)皿、 量筒等浸入含有洗滌劑的 水中， 用毛刷刷洗， 然后用自來水及蒸餾水沖凈。 移液管先用含有洗滌劑的水浸泡。再用自 來水及蒸餾水沖洗，洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2 滅菌前玻璃

10、器皿的包裝（1）培養(yǎng)皿的包裝 培養(yǎng)皿由一蓋底組成一套?？捎脠?bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或 者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。 包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。（2）移液管的包裝 在移液管的上端塞入小段棉花 （ 勿用脫脂棉 ） 。它的作用是避免外 界及口中雜菌吹入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約 0.5cm 左有。 棉花自身長度約 1-1 5cm。塞棉花時(shí)，可用一外圈拉直的曲別針，將少許棉花塞入管口內(nèi)。 棉花要塞得松緊適宜，吹時(shí)以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。先將報(bào)紙裁成寬約 5cm 左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報(bào)紙的一 端，約成 45

11、度角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面 上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌（ 見圖 51 1） 。v1.0 可編輯可修改(二) 液體及固體培養(yǎng)基的配制過程1 液體培養(yǎng)基配制(1) 稱量一般可用 1/100 粗天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品。先按培養(yǎng)基配方計(jì)算 各成分的用量，然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。(2) 溶化 將稱好的藥品置于一燒杯中， 先加入少量水 ( 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來水或蒸餾 水) ，用玻棒攪動(dòng)，加熱溶解。(3) 定容 待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少 時(shí)，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積

12、溶液，加入至培養(yǎng)基中。(4) 調(diào) pH 一般用 pH試紙測定培養(yǎng)基的 pH。用剪刀剪出一小段 pH試紙， 然后用鑷子夾 取此段 pH試紙， 在培養(yǎng)基中蘸一下， 觀看其 pH范圍， 如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)， 可用 1mol/l NaOH或 1mol/l HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié) pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入 NaOH或 HCl 溶液，防止局部過 酸或過堿， 破壞培養(yǎng)基中成分。 邊加邊攪拌， 并不時(shí)用 pH試紙測試， 直至達(dá)到所需 pH 為止。(5) 過濾 用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時(shí)，此步可省去。2 固體培養(yǎng)基的配制配制固體培養(yǎng)基時(shí)， 應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸， 再將稱好的瓊脂 (15

13、-2) 加入， 并用玻棒不斷攪拌， 以免糊底燒焦。 繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化， 最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分。v1.0 可編輯可修改（ 三） 培養(yǎng)基的分裝根據(jù)不同需要， 可將己配好培養(yǎng)基分裝入試管或錐形瓶內(nèi)， 分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾 污管口或瓶口， 造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)， 可用鑷子夾一小塊脫 脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。1 試管的分裝取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上， 漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡 皮管的中部加一彈簧夾。 分裝時(shí)， 用左手拿住空試管中部， 并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管 內(nèi)， 以右手拇指及食指開放彈簧夾， 中指及無名指夾住

14、玻璃管嘴， 使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi) （圖 512） 。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度 14 左右為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后， 應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高 1 5（約 34m1）；半固 體培養(yǎng)基分裝量為管高的 13 為宜。2 錐形瓶的分裝用于振蕩培養(yǎng)微生物用時(shí)，可在 250 m1 錐形瓶中加入 50 ml 的液體培養(yǎng)基，若用于制v1.0 可編輯可修改作平板培養(yǎng)基用時(shí)， 可在 250 m1錐形瓶中加入 150ml 培養(yǎng)基， 然后再加入 3g 瓊脂粉 （按 2

15、計(jì)算 ） ，滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化。（四） 棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎為了培養(yǎng)好氣性微生物， 需提供優(yōu)良通氣條件， 同時(shí)為防止雜菌污染， 則必須對通入試 管或錐形瓶內(nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌。通常方法是在試管及錐形瓶口加上棉花塞等。1 試管棉塞的制作 制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的圓孔上， 用右手食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞， 然后直接壓入試管或錐形瓶口。 也可借用玻 璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞（圖 5 13） 。制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁， 不留縫隙， 以防外界微生物沿縫隙侵入。 棉塞不宜過緊或過松，塞 好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉

16、塞的23 在試管內(nèi)， 1 3在試管外 （圖 5 1 4） 。目前也有采用金屬或塑料試管帽代替棉塞。直接蓋在試管口上。滅菌待用。v1.0 可編輯可修改將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管擁成一捆， 外面包上一層牛皮紙。 用鉛筆注明培 養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。2 錐形瓶棉塞制作 通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量， 則可用 8 層紗布代替棉塞包在瓶口上。 目前也有采用無菌培養(yǎng)容器封口膜直接蓋在瓶口， 既 保證良好通氣，過濾除菌又操作簡便，故極受歡迎。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包上八層紗布或蓋好培養(yǎng)容器封口膜的錐形瓶口上， 再包上 一層牛皮紙并用線繩捆好

17、，滅菌待用。（五）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎之后，應(yīng)立即進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，100Pa 滅菌 20min （滅菌條件根據(jù)培養(yǎng)基不同有所差異，含糖培養(yǎng)基 105， 30min）。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)暫存 于冰箱中。（六）斜面和平板的制作1 斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管， 趁熱置于木棒上， 使成適當(dāng)斜度， 凝固后即成斜面 （ 圖 5 1 5） 。斜面長度不超過試管長度 12 為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌 后則應(yīng)垂直放置至冷凝。2 平板的制作將裝在錐形瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至 50左右傾入無菌培養(yǎng)皿 中。溫度過高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多，溫度低于 50，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。平板的制作應(yīng)采用無菌操作， 左手拿培養(yǎng)皿， 右手拿錐形瓶的底部或試管， 左于同時(shí)用 小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，月左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入， 傾入 10-12m1 的培養(yǎng)基， 迅速蓋好皿蓋， 置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿、使培養(yǎng)基均勻分布于整 個(gè)平皿中、冷凝后即成平板 （圖 516）。v1.0 可編輯可