土壤酶活性測定方法

1、土壤酶活性測定方法土壤脲酶的測定方法(苯酚鈉次氯酸鈉比色法一、原理脲酶存在于大多數(shù)細菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專性的,它僅能水解尿素,水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性,與土壤的微生物數(shù)量、有機物質(zhì)含量、全氮和速效磷含量呈正相關(guān)。根際土壤脲酶活性較高,中性土壤脲酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。土壤中脲酶活性的測定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應后測定生成的氨量,也可以通過測定未水解的尿素量來求得。本方法以尿素為基質(zhì),根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚次氯酸鈉作用生成藍色的靛酚,來分析脲酶活性。二、試劑1甲苯210%尿素:稱取10g尿素,用水溶至100ml。

2、3檸檬酸鹽緩沖液(PH6.7:184g檸檬酸和147.5g氫氧化鉀(KOH溶于蒸餾水。將兩溶液合并,用1mol/LNaOH將PH調(diào)至6.7,用水稀釋定容至1000ml。4苯酚鈉溶液(1.35mol/L:62.5g苯酚溶于少量乙醇,加2ml甲醇和18.5ml丙酮,用乙醇稀釋至100ml(A液,存于冰箱中;27gNaOH溶于100ml水(B液。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將A液、B液各20ml混合,用蒸餾水稀釋至100ml。5次氯酸鈉溶液:用水稀釋試劑,至活性氯的濃度為0.9%,溶液穩(wěn)定。6氮的標準溶液:精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml,得到1ml含有0.1mg 氮的標準

3、液;再將此液稀釋10倍(吸取10ml標準液定容至100ml制成氮的工作液(0.01mg/ml。三、操作步驟稱取5g土樣于50ml三角瓶中,加1ml甲苯,振蕩均勻,15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7檸檬酸鹽緩沖溶液,搖勻后在37恒溫箱培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后過濾,過濾后取1ml濾液加入50ml容量瓶中,再加4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液,隨加隨搖勻。20min后顯色,定容。1h內(nèi)在分光光度計與578nm波長處比色。(靛酚的藍色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定。標準曲線制作:在測定樣品吸光值之前,分別取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液,移于50ml容量瓶中,然后補加蒸

4、餾水至20ml。再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液,隨加隨搖勻。20min后顯色,定容。1h內(nèi)在分光光度計上于578nm波長處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。注意事項:1、每一個樣品應該做一個無基質(zhì)對照,以等體積的蒸餾水代替基質(zhì),其他操作與樣品實驗相同,以排除土樣中原有的氨對實驗結(jié)果的影響。2、整個實驗設置一個無土對照,不加土樣,其他操作與樣品實驗相同,以檢驗試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過標曲的最大值,則應該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計算:以24小時后1g土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性(Ure。Ure=(a樣品-a無土

5、-a無基質(zhì)×V×n/m式中:a樣品為樣品吸光值由標準曲線求得的NH3-N毫克數(shù);a無土為無土對照吸光值由標準曲線求得的NH3-N毫克數(shù);a無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光值由標準曲線求得的NH3-N毫克數(shù);V為顯色液體積;n為分取倍數(shù),浸出液體積/吸取濾液體積;m表示烘干土重土壤磷酸酶活性測定(磷酸苯二鈉比色法一、原理測定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機基團量或無機磷量計算磷酸酶活性。前一種通常稱為有有機基團含量法,是目前較為常用的測定磷酸酶的方法,后一種稱為無機磷含量法。研究證明:磷酸酶有三種最適PH值:45、67、810。因此,測定酸性、中性和堿性土壤的磷酸酶,要提供相應的PH緩沖液

6、才能測出該土壤的磷酸酶最大活性。測定磷酸酶常用的PH緩沖體系有乙酸鹽緩沖液(PH5.05.4、檸檬酸鹽緩沖液(PH7.0、三羥甲基氨基甲烷緩沖液(PH7.08.5、和硼酸緩沖液(PH910。磷酸酶測定時常用基質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚酞磷酸鈉、甘油磷酸鈉、-或者-萘酚磷酸鈉等。現(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑1緩沖液:(1醋酸鹽緩沖液(PH 5.00.2mol/L 醋酸溶液11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸鈉溶液16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液稀釋

7、至1L.(2檸檬酸鹽緩沖液(PH 7.00.1mol/L 檸檬酸溶液19.2g C6H7O8溶至1L.取6.4ml 0.1mol/L 檸檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液稀釋至100ml.(3硼酸鹽緩沖液(PH 9.60.05mol/L 硼砂溶液19.05g 硼砂溶至1L.0.2mol/L NaOH溶液8g NaOH溶至1L.取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀釋至200ml.20.5% 磷酸苯二鈉(用緩沖液配制3氯代二溴對苯醌亞胺試劑:稱取0.125g氯代二溴對苯醌亞胺,用10ml 96%乙醇溶解,貯于棕色瓶中,存放在冰箱

8、里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。4甲苯50.3%硫酸鋁溶液6酚標準溶液酚原液:取1g重蒸酚溶于蒸餾水中,稀釋至1L,存于棕色瓶中。酚工作液(0.01mg/ml:取10ml酚原液稀釋至1L。三、操作步驟稱5g土樣置于200ml三角瓶中,加2.5ml甲苯,輕搖15min后,加入20ml 0.5%磷酸苯二鈉(酸性磷酸酶用乙酸鹽緩沖液;中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液;堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液,仔細搖勻后放入恒溫箱,37下培養(yǎng)24h。然后在培養(yǎng)液加入100ml 0.3%硫酸鋁溶液并過濾。吸取3ml濾液于50ml容量瓶中,然后按繪制標準曲線方法顯色。用硼酸緩沖液時,呈現(xiàn)藍色,于分光光度計上660nm處

9、比色。標準曲線繪制:取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液,置于50ml容量瓶中,每瓶加入5ml硼酸緩沖液和4滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑,顯色后稀釋至刻度,30min后,在分光光度計上660nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。注意事項:1、每一個樣品應該做一個無基質(zhì)對照,以等體積的蒸餾水代替基質(zhì),其他操作與樣品實驗相同,以排除土樣中原有的氨對實驗結(jié)果的影響。2、整個實驗設置一個無土對照,不加土樣,其他操作與樣品實驗相同,以檢驗試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過標曲的最大值,則應該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計算以24h后1g土壤中釋放

10、出的酚的質(zhì)量(mg表示磷酸酶活性。磷酸酶活性=(a樣品-a無土-a無基質(zhì)×V×n/m式中:a樣品為樣品吸光值由標準曲線求得的酚毫克數(shù);a無土為無土對照吸光值由標準曲線求得的酚毫克數(shù);a無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光值由標準曲線求得的酚毫克數(shù);V為顯色液體積;n為分取倍數(shù),浸出液體積/吸取濾液體積;m表示烘干土重土壤蔗糖酶活性測定(3,5- 二硝基水楊酸比色法一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性,如與土壤有機質(zhì)、氮、磷含量,微生物數(shù)量及土壤呼吸強度有關(guān),一般情況下,土壤肥力越高,蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸

11、。顏色深度與還原糖量相關(guān),因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、試劑1酶促反應試劑:基質(zhì)8%蔗糖,pH5.5磷酸緩沖液:1/15M磷酸氫二鈉(11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸餾水中0.5ml加1/15M磷酸二氫鉀(9.078g KH2PO4溶于1L蒸餾水中9.5ml即成,甲苯2葡萄糖標準液(1mg/mL預先將分析純葡萄糖置80烘箱內(nèi)約12小時。準確稱取50mg葡萄糖于燒杯中,用蒸餾水溶解后,移至50mL容量瓶中,定容,搖勻(冰箱中4保存期約一星期。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象,則應棄之,重新配制。3 3,5- 二硝基水楊酸試劑(DNS試劑稱0.5g二硝基水

12、楊酸,溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中,再加30g酒石酸鉀鈉,用水稀釋定容至100ml(保存期不過7天。三、操作步驟(1標準曲線繪制分別吸1 mg/mL的標準葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于試管中,再補加蒸餾水至1mL,加DNS試劑3mL混勻,于沸水浴中準確反應5min(從試管放入重新沸騰時算起,取出立即泠水浴中冷卻至室溫,以空白管調(diào)零在波長540nm處比色,以OD值為縱坐標,以葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。(2土壤蔗糖酶測定稱取5 g土壤,置于50mL三角瓶中,注入15ml 8%蔗糖溶液,5ml pH 5.5磷酸緩沖液和5滴甲苯。搖勻混合物后,放入

13、恒溫箱,在37下培養(yǎng)24h。到時取出,迅速過濾。從中吸取濾液1ml,注入50ml容量瓶中,加3ml DNS試劑,并在沸騰的水浴鍋中加熱5min,隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色,最后用蒸餾水稀釋至50ml,并在分光光度計上于508nm處進行比色。(為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差,每一土樣需做無基質(zhì)對照,整個試驗需做無土壤對照;如果樣品吸光值超過標曲的最大值,則應該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。四、結(jié)果計算:蔗糖酶活性以24h,1g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性=(a樣品-a無土-a無基質(zhì)×n/ma樣品、a無土、a

14、無機質(zhì)分別表示其由標準曲線求的葡萄糖毫克數(shù);n為分取倍數(shù);m表示烘干土重土壤纖維素酶活性測定(3,5- 二硝基水楊酸比色法一、原理纖維素是植物殘體進入土壤的碳水化合物的重要組分之一。在纖維素酶作用下,它的最初水解產(chǎn)物是纖維二糖,在纖二糖酶作用下,纖維二糖分解成葡萄糖。所以,纖維素酶是碳素循環(huán)中的一個重要的酶。纖維素酶解所生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān),因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、試劑1甲苯21%羧甲基纖維素溶液:1g 羧甲基纖維素鈉,用50%的乙醇溶至100ml。3pH5.5醋酸鹽緩沖液:0.2mol/L

15、醋酸溶液11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸鈉溶液16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液混勻即成PH 5.5醋酸鹽緩沖液.43,5-二硝基水楊酸溶液:稱1.25g二硝基水楊酸,溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中,再加75g酒石酸鉀鈉,用水稀釋至250ml(保存期不過7天,5葡萄糖標準液(1mg/mL預先將分析純葡萄糖置80烘箱內(nèi)約12小時。準確稱取50mg葡萄糖于燒杯中,用蒸餾水溶解后,移至50mL容量瓶中,定容,搖勻(冰箱中4保存期

16、約一星期。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象,則應棄之,重新配制。三、操作步驟葡萄糖標準曲線:分別吸1mg/mL的標準葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于試管中,再補加蒸餾水至1mL,加DNS溶液3ml混勻,于沸騰水浴中加熱5min,取出立即泠水浴中冷卻至室溫,以空白管調(diào)零在波長540nm處比色,以OD值為縱坐標,以葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。稱10g土壤置于50ml三角瓶中,加入1.5ml甲苯,搖勻后放置15min,再加5ml 1%羧甲基纖維素溶液和5ml pH5.5醋酸鹽緩沖液,將三角瓶放在37恒溫箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后,過濾并取1ml濾液,然后按繪制標準曲線顯

17、色法比色測定。(為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差,每一土樣需做無基質(zhì)對照,整個試驗需做無土壤對照;如果樣品吸光值超過標曲的最大值,則應該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。四、結(jié)果計算纖維素酶活性以72h,1g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。纖維素酶活性=(a樣品-a無土-a無基質(zhì)×n/ma樣品、a無土、a無機質(zhì)分別表示其由標準曲線求的葡萄糖毫克數(shù);n為分取倍數(shù);m表示烘干土重過氧化氫酶活性測定(高錳酸鉀滴定法一、原理過氧化氫廣泛存在于生物體和土壤中,是由生物呼吸過程和有機物的生物化學氧化反應的結(jié)果產(chǎn)生的,這些過氧化氫對生物和土壤具有毒害作用。與此同時,在生物體和土壤中存有過氧化氫酶

18、,能促進過氧化氫分解為水和氧的反應(H2O2H2O+O2,從而降低了過氧化氫的毒害作用。土壤中過氧化氫酶的測定便是根據(jù)土壤(含有過氧化氫酶和過氧化氫作用析出的氧氣體積或過氧化氫的消耗量,測定過氧化氫的分解速度,以此代表過氧化氫酶的活性。測定過氧化氫酶的具體方法比較多,如氣量法:根據(jù)析出的氧氣體積來計算過氧化氫酶的活性;比色法:根據(jù)過氧化氫與硫酸銅產(chǎn)生黃色或橙黃色絡合物的量來表征過氧化氫酶的活性;滴定法:用高錳酸鉀溶液滴定過氧化氫分解反應剩余過氧化氫的量,表示出過氧化氫酶的活性。本實驗重點采用高錳酸鉀滴定法。二、試劑2mol/L H2SO4溶液:量取5.43ml的濃硫酸稀釋至500ml,置于冰箱貯存;0.02mol/L高錳酸鉀溶液:稱取1.7g高錳酸鉀,加入400mL 水中,緩緩煮沸15min,冷卻后定容至500mL,避光保存,用時用0.1mol/L草酸溶液標定;0.1mol/L草酸溶液:稱取優(yōu)級純H2C2O42H2O 3.334g,用蒸餾水溶解后,定容至250ml; 3%的H2O2水溶液:取30% H2O2溶液25ml,定容至250ml,置于冰箱貯存,用時用0.1mol/L KmnO4溶液標定。三、操作步驟分別取5g土壤樣品于具塞三角瓶中(用不加土樣的作空白對照,加入0