實(shí)驗(yàn)9水中總大腸菌群的測定—多管發(fā)酵法

1、實(shí)驗(yàn)九 水中總大腸菌群的測定多管發(fā)酵法一實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?掌握多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群的技術(shù)。 2預(yù)習(xí)第六章細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)法的關(guān)內(nèi)容。二原理總大腸菌群可用多管發(fā)酵法或?yàn)V膜法檢驗(yàn)。 多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌 群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān) 特性，通過三個(gè)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。 試驗(yàn)結(jié)果以最可能數(shù) （ most probable numbe）r ，簡稱 MPN 表示。三儀器（1）高壓蒸氣滅菌器。（2）恒溫培養(yǎng)箱、冰箱。（3）生物顯微鏡、載玻片。（4）酒精燈、鎳鉻絲接種棒。（5）培養(yǎng)皿（直徑100mm）、試管（5X 150mm）,吸管（1、5、

2、10mL）、燒杯 （200、500、2000mL）、錐形瓶（500、1000mL）、采樣瓶。四培養(yǎng)基及染色劑的制備1 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：將10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化鈉加 熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH為7.27.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙 醇溶液1mL,充分混勻，分裝于試管中，于 121 °C高壓滅菌器中滅菌15min,貯 存于冷暗處備用。2三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液： 按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的制備方法配制。 除蒸餾水外，各組份用量增加至三倍。3品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基： 貯備培養(yǎng)基的制備：于 2000mL燒杯中，先將2030g瓊脂加到900mL 蒸餾水中，加

3、熱溶解，然后加入 3.5g磷酸氫二鉀及10g蛋白胨，混勻，使其溶 解，再用蒸餾水補(bǔ)充到1000mL，調(diào)節(jié)溶液pH為7.27.4。趁熱用脫脂棉或絨 布過濾，再加入10g乳糖，混勻，定量分裝于250mL或500mL錐形瓶內(nèi)，置于 高壓滅菌器中，在121C滅菌15mi n,貯存于冷暗處備用。 平皿培養(yǎng)基的制備： 將上法制備的貯備培養(yǎng)基加熱融化。 根據(jù)錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例吸取一定量的5%堿性品紅乙醇溶液，置于滅菌試管中；再按比例稱取無水亞硫酸鈉， 置于另一滅菌試管內(nèi)， 加滅菌水少許使其 溶解，再置于沸水浴中煮沸 10min （滅菌）。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉 溶液，滴加于堿性品

4、紅乙醇溶液內(nèi)至深紅色再褪至淡紅色為止（不宜加多） 。將 此混合液全部加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡）。立即將此培養(yǎng)基適量（約15mL）傾入已滅菌的平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi) 備用，但保存時(shí)間不宜超過兩周。 如培養(yǎng)基已由淡紅色變成深紅色， 則不能再用。4伊紅美培養(yǎng)基： 貯備培養(yǎng)基的制備：于 2000mL燒杯中，先將2030g瓊脂加到900mL 蒸餾水中，加熱溶解。再家人 2.0g鄰酸二氫鉀及10g蛋白胨，混合使之溶解， 用蒸餾水補(bǔ)充至1000mL，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.27.4。趁熱用脫脂棉或絨布過 濾，再加入10g乳糖，混勻后定量分裝于 250mL或500mL錐形瓶內(nèi)，

5、于121C 高壓滅菌15mi n,貯于冷暗處備用。 平皿培養(yǎng)基的制備： 將上述制備的貯備培養(yǎng)基融化。 根據(jù)錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)基 的容量，用滅菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的2%伊紅水溶液（ 0.4g 伊紅溶于20mL水中）和一定量已滅菌的 0.5%美藍(lán)水溶液（0.065g美藍(lán)溶于13mL水 中），加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)， 并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡） ，立即將此培養(yǎng) 基適量傾入已滅菌的空平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用。5革蘭氏染色劑： 結(jié)晶紫染色液：將20mL結(jié)晶紫乙醇飽和溶液（稱取 48g結(jié)晶紫溶于 100mL95乙醇中）和80mL 1財(cái)酸銨溶液混合、過濾。該溶液放置過久會產(chǎn)生沉 淀，不能

6、再用。 助染劑： 將 1g 碘與 2g 碘化鉀混合后， 加入少許蒸餾水， 充分振蕩， 待完全溶解后，用蒸餾水補(bǔ)充至300mL此溶液兩周內(nèi)有效。當(dāng)溶液由棕黃色變?yōu)榈?黃色時(shí)應(yīng)棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。 脫色劑： 95%乙醇。 復(fù)染劑：將0.25g沙黃加到10mL95乙醇中，待完全溶解后，加 90mL蒸 餾水。五測定步驟1 生活飲用水： 初發(fā)酵試驗(yàn)：在兩個(gè)裝有已滅菌的 50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中（內(nèi)有倒管），以無菌操作各加入已充分混勻的水樣100mL在10支裝有已滅菌的5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），以無菌

7、 操作加入充分混勻的水樣10mL混勻后置于37C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。 平板分離： 上述各發(fā)酵管經(jīng)培養(yǎng) 24h 后，將產(chǎn)酸、 產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管 分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基或品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，置于 37 E恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 24h，挑選符合下列特征的菌落：a 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或 略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。b 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶 或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心色較深的菌落。 取上述特征的群落進(jìn)行革蘭氏染色：a 用以培養(yǎng)1824h的培養(yǎng)物涂片，涂層要?。籦. 將涂片在火焰上加溫固定，待冷

8、卻后滴加結(jié)晶紫溶液，1min后用水洗去；c. 滴加助色劑，1min后用水洗去；d. 滴加脫色劑，搖動玻片，直止無紫色脫落為止（約2030s），用水洗去；e. 滴加復(fù)染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌， 呈紅色者為陰性菌。 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)： 上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌， 則挑選 該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中 （內(nèi)有倒管）， 每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最典型菌落 13個(gè)，然后置于37C恒 溫箱中培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者（不論倒管內(nèi)氣體多少皆作為產(chǎn)氣論），即證 實(shí)有大腸菌群存在。根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)查

9、附表 1“大腸 菌群檢數(shù)表”，報(bào)告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。2.水源水于各裝有5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的 5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），分 第3 頁共4 頁別加入10mL水樣；于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒管）， 分別加入1mL水樣；再于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個(gè)試管中（內(nèi)有倒 管），分別加入1mL1 : 10稀釋的水樣。共計(jì)15管，三個(gè)稀釋度。將各管充分混 勻，置于37C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。 平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)的檢驗(yàn)步驟同“生活飲用水檢驗(yàn)方法”。 根據(jù)證實(shí)總大腸菌群存在的陽性管數(shù)，查附表 2 “最可能數(shù)（MPN表”， 即求得每100mL水樣中存在的總大腸菌群數(shù)

10、。我國目前系以 1L為報(bào)告單位，故 MPN值再乘以10，即位1L水樣中的總大腸菌群數(shù)。例如，某水樣接種10mL的 5管均為陽性；接種1mL的 5管中有2管為陽性； 接種1 : 10的水樣1mL的5管均為陰性。從最可能數(shù)（MPN表中查檢驗(yàn)結(jié)果5 20,得知100mL水樣中的總大腸菌群數(shù)為49 個(gè),故1L水樣中的總大腸菌群數(shù) 為 49X 10=490個(gè)。對污染嚴(yán)重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗(yàn)的接種水樣應(yīng)做1 ： 10、1 ： 100、1 : 1000或更高倍數(shù)的稀釋，檢驗(yàn)步驟同“水源水”檢驗(yàn)方法。如果接種的水樣量不是10mL 1mL和0.1mL,而是較低或較高的三個(gè)濃度的 水樣量，也可查表求得 MP

11、N旨數(shù)，再經(jīng)下面公式換算成每100mL的 MPNS：MPN 值=MPN 指數(shù)10（mL）接種量最大的一管(mL)附表1大腸菌群檢數(shù)表接種水樣總量 300mL （ 100mL2份，10mL10份）100mL水量的陽性瓶數(shù)10mL水量的陽性管數(shù)0121L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)0<3411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230附表2最可能數(shù)（MPN表（接種5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份O.ImL水樣時(shí)，不同陽性及陰性情況下100mL水樣中細(xì)

12、菌數(shù)的最可能數(shù)和95祠信限值）出現(xiàn)陽性份數(shù)每 100mL水樣中細(xì) 菌數(shù)的最 可能數(shù)95冏信限值出現(xiàn)陽性份數(shù)每 100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可 能數(shù)95%可信限值10mL管1 mL管0.1 mL管下限上限10mL管1 mL管0.1mL管下限上限000<220171170012<0.5721071170102<0.5721192210204<0.51122092211002<0.57230123281014<0.51130081191104<0.515301112251116<0.515310112251206<0.515311144342005<0.5133201443432117546520491713033017546521702317040013331522942822040117546530792519041017546531110312504112176353214037310412269785331804450042022767540130353004212697854117043190