第五章酶與細(xì)胞固定化技術(shù)

1、第五章 酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)教學(xué)目的：使學(xué)生了解并掌握固定化酶（細(xì)胞、原生質(zhì)體）的概念及意義，掌握酶的常用固定化技術(shù)，了解固定化酶的性質(zhì)。教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：固定化酶（細(xì)胞、原生質(zhì)體）的范疇，各種固定化技術(shù)。固定化酶（細(xì)胞、原生質(zhì)體）的范疇,半透膜包埋法。教學(xué)方法：講授教學(xué)手段：多媒體第一節(jié) 概述一、游離酶使用中的局限性: 1.提取純化繁瑣,價(jià)格昂貴 2.難以重復(fù)使用 3.穩(wěn)定性差二、固定化酶研究克服游離酶缺點(diǎn)的方法之一50年代開始60年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展1969年，千田一郎首次在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-AA連續(xù)生產(chǎn)L-AA實(shí)現(xiàn)酶應(yīng)用史上的一大變革三、基本概念1、固定化酶（

2、1971第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會(huì)議）（Immobilized Enzyme) 指在一定空間范圍內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)利用。包括酶與不溶性載體結(jié)合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝膠或超濾裝置中的酶。2、固定化細(xì)胞（原生質(zhì)體） 指被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定空間范圍內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。四、固定化酶優(yōu)點(diǎn)增加了酶的穩(wěn)定性能降低酶的總體費(fèi)用酶的分離和回收變得容易，并可重復(fù)使用使反應(yīng)過程的連續(xù)操作成為可能反應(yīng)產(chǎn)物也易于提取純化有利于過程設(shè)計(jì)和優(yōu)化拓廣了酶的應(yīng)用范圍（多酶系統(tǒng)的酶反應(yīng)，非水相酶反應(yīng)

3、，生物傳感器探頭等） 第二節(jié)、酶的固定化方法一、酶的固定化方法1、酶的固定化方法（四大類方法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交聯(lián)法 4）化學(xué)共價(jià)法 其它（酶的逆膠束包囊法）一、酶的固定化方法2、選擇方法依據(jù)： 酶的性質(zhì) 載體的來源、價(jià)格、機(jī)械性能、載體的功能基團(tuán)和交聯(lián)度等 制備方法簡便易行 衡量依據(jù)： 測定固定化酶的活力，以確定固定化過程的活力回收率； 研究它的最適反應(yīng)條件（底物濃度、pH 值、溫度、離子強(qiáng)度等）； 穩(wěn)定性和不穩(wěn)定原因的探究； 對酶進(jìn)行人工修飾，使其與載體的結(jié)合達(dá)到較為理想的構(gòu)型和相容性。（一）吸附法1、原理：主要是利用細(xì)胞與載體之間的吸引力（范德華力、離子鍵和氫鍵），使細(xì)胞固

4、定在載體上，常用的吸附劑有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纖維等。     此外還可利用專一的親和力來固定細(xì)胞，例如伴刀豆球蛋白與一甘露聚糖具有親和力，而釀酒酵母細(xì)胞壁上含有一甘露聚糖，故可將伴刀豆球蛋白先連接到載體上，然后把酵母連接到活化了的伴刀豆球蛋白上。2、酶材料：酶或結(jié)合在菌體（死細(xì)胞）及細(xì)胞碎片上的酶或酶系。 3、優(yōu)缺點(diǎn)：操作簡便，條件溫和，不會(huì)引起酶的變性失活，載體廉價(jià)易得，且可反復(fù)利用；缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)與載體之間的結(jié)合相當(dāng)弱,而且很多情況下,酶的非特異性吸附常常會(huì)引起部分或全部失活,高濃度的鹽溶液或底物溶液又將加速蛋白質(zhì)的脫附.因此當(dāng)要求酶的

5、固定絕對牢靠時(shí),采用吸附法是很不可靠的.4、常用吸附劑 各種礦物質(zhì)以及無機(jī)載體(氧化鋁，氧化鐵，氧化鈦，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羥基磷灰石等)，及天然高分子載體淀粉、白蛋白等，最常用的吸附劑是離子交換劑羧甲基纖維素，DEAE-纖維素、DEAE-葡萄糖，合成的陰離子和陽離子交換劑離子交換劑主要靠靜電吸引，缺點(diǎn)是當(dāng)離子強(qiáng)度增加或介質(zhì)的pH、溫度變化時(shí)，這種結(jié)合發(fā)生分解。5、舉例：將伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含 0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）與酶液(10mg/ml) 5ml,在4，攪勻過夜，便成瓊脂糖復(fù)合物，用10mM

6、NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗滌，直至測不出活性為度，最后再懸浮于10ml NaAc PBS中備用。（二） 包埋法1、概念：指將酶或含酶菌體包埋在各種多空載體中，使酶固定的方法。 可分為凝膠包埋法（網(wǎng)格型）和半透膜包埋法（微囊型）兩種。2、優(yōu)缺點(diǎn)：一般不需酶的AA殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率高；缺點(diǎn)是包埋時(shí)發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)，酶易失活，須巧妙設(shè)計(jì)反應(yīng)條件。另外網(wǎng)格結(jié)構(gòu)影響底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，有時(shí)，這種擴(kuò)散會(huì)導(dǎo)致酶動(dòng)力學(xué)行為的改變，所以此法只適合于小分子底物和產(chǎn)物的酶。3、 海藻酸鹽包埋法 海藻酸鈉與Ca2+,Mg2+,Al3+等多價(jià)離子間的轉(zhuǎn)

7、移凝膠作用,形成固定化細(xì)胞顆粒缺點(diǎn): 在高濃度電介質(zhì)（K+,Na+）溶液中,固定化顆粒變得不穩(wěn)定. Ca2+等多價(jià)離子在磷酸緩沖溶液中易形成沉淀,固定化顆粒溶解優(yōu)點(diǎn): 海藻酸鹽價(jià)格便宜 包埋條件溫和4、角叉菜糖包埋法 K-角叉菜是一種含有許多硫酸根基團(tuán)的多糖化合物.在K+離子存在下，它能立即生成凝膠.缺點(diǎn): 對高濃度的Na+離子敏感 固定化溫度高,需要在3755 5、聚丙烯酰胺凝膠 在含酶(或細(xì)胞)的水溶液中，加入一定比例的單體丙烯酰胺和膠聯(lián)劑N,N-甲撐雙丙烯酰胺.然后在催化劑(二甲氨基丙腈)和引發(fā)劑(過硫酸鉀)的作用下低溫(冰浴)聚合,形成凝膠缺點(diǎn): 丙烯酰胺對酶具有變性作用6、聚乙烯醇（

8、PVA）包埋法 磷酸鹽硬化法,循環(huán)冷凍法,硼酸硬化法硼酸硬化法: 將聚乙烯醇在70 80進(jìn)行水浴加熱至完全溶解,然后冷卻至35,與酶溶液(細(xì)胞懸浮液)混勻,滴加到飽和硼酸溶液中優(yōu)點(diǎn): 原材料價(jià)格便宜 條件溫和 無毒害作用 循環(huán)冷凍法 硼酸硬化法7、半透膜包埋法7.1 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度極低而形成被膜將酶包埋。操作：酶液在油溶性表面活性劑存在下在水不互溶的有機(jī)相中乳化形成油包水的微滴，再將溶于有機(jī)溶劑的高聚物加入乳化液中，然后加入一種不溶解高聚物的有機(jī)溶劑，使高聚物在油-水界面上沉淀析出，形成膜將酶包埋，最后在乳化劑幫助下由有機(jī)相移入水相。7、半透膜包埋法7.

9、2界面聚合法 利用親水性單體和疏水性單體在界面發(fā)生聚合的原理包埋酶。例: 將含10%血紅蛋白的酶液與1，6己二胺的水溶液混合，立即在含1%司盤-85的氯仿-環(huán)己烷中分散乳化，再加入溶于有機(jī)相的葵二酰氯后，便在油-水界面上發(fā)生聚合反應(yīng)，形成尼龍膜，將酶包埋。（三） 交聯(lián)法 基本原理：酶分子和多功能試劑之間形成共價(jià)鍵得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，以戊二醛使用最廣泛OHC（CH2）3CHO，使載體的氨基和酶蛋白中的氨基交聯(lián)形成席夫堿（基）Shiff 堿將酶固定化。含氨基的載體，可用氯乙基纖維素（纖維素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纖維素（DEAE-纖維素）。雙功能試劑除了戊二醛外，還有乙撐二異氰酸酯

10、OCN（CH2）6NCO。交聯(lián)劑的特點(diǎn)：帶有二個(gè)以上的功能基團(tuán)。反應(yīng)比較劇烈條件比較嚴(yán)格。操作方便，活力回收不高。固定化分兩步進(jìn)行，第一步形成可溶性分子間交聯(lián)絡(luò)合物，第二步是快速反應(yīng)導(dǎo)致固化。交聯(lián)法有5種形式：酶直接交聯(lián)法在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑的濃度、溶液pH 和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的平衡。此法操作簡單，一種多功能試劑可制備許多酶衍生物，但缺乏選擇性，難于避免分子內(nèi)交聯(lián)，活力回收往往不高。酶輔助蛋白交聯(lián)：為避免分子內(nèi)交聯(lián)和在交聯(lián)過程中因化學(xué)修飾而引起失活，可使用第二個(gè)“載體”蛋白質(zhì)（即輔助蛋白質(zhì)，如白蛋白、明膠、血紅蛋白等）來增加蛋白質(zhì)濃度

11、，使酶與惰性蛋白質(zhì)共交聯(lián)。實(shí)用中，當(dāng)酶蛋白、無酶活性蛋白與戊二醛混合（戊二醛最終濃度0.7%）后，混合液粘度開始提高時(shí)，立即鋪膜，或者在酶蛋白戊二醛與輔助蛋白混合后，經(jīng)-30低溫處理，再預(yù)熱至4而得泡沫狀蛋白質(zhì)共聚物。這種固定化酶為多孔性，活力回收比酶直接交聯(lián)高，機(jī)械性能也有改進(jìn)。吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。此法用于胞外酶的固定化較好，尤其是從發(fā)酵液和粗酶制劑中直接固定化時(shí)，載體的選擇性吸附有一定純化作用，而酶分子之間的共價(jià)交聯(lián)又保證酶分子緊緊地結(jié)合于載體上，而且酶分子僅

12、存在于載體表面，使固定化酶與底物接觸良好。由于載體本身有較好機(jī)械性能，所以產(chǎn)生的固定化酶裝柱流動(dòng)性能好，缺點(diǎn)是必須保證酶吸附在載體上。載體交聯(lián)法：用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體，而其中另一部分功能基團(tuán)偶連酶蛋白。也可利用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)與一種聚合物的單體反應(yīng)，反應(yīng)后再與酶一起共聚。交聯(lián)包埋法：把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的集合體，然后用高分子或多糖一類物質(zhì)進(jìn)行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細(xì)的缺點(diǎn)，同時(shí)制得的固定化酶穩(wěn)定性好戊二醛交聯(lián)法缺點(diǎn)： 雙功能基團(tuán)試劑與酶蛋白的交聯(lián)作用，常引起蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的改變，使酶失活。 為了避免或減少酶在交聯(lián)過程中失活，可在被交

13、聯(lián)的酶蛋白溶液中添加一定量的輔助蛋白。（四） 化學(xué)共價(jià)法1、概念所謂共價(jià)法就是使酶蛋白的非必需基團(tuán)（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，咪唑基，吲哚基）通過共價(jià)鍵和不溶性載體形成不可逆的聯(lián)接。要使載體與酶形成共價(jià)鍵，必需首先使載體活化，接上一活潑基團(tuán)，再與酶反應(yīng)2、用于共價(jià)法固定的酶蛋白上的功能基團(tuán): 1）氨基-賴氨酸上的-氨基以及多肽鏈N末端氨基酸上的- 氨基; 2）羧基-雙羧基氨基酸:門冬氨基酸和谷氨酸上的游離羧基,以及多肽鏈末端的- 羧基; 3）酪氨酸上的苯酚環(huán); 4）半胱氨酸上的巰基; 5）羥基-絲氨酸,蘇氨酸以及酪氨酸上的羥基 6）組氨酸上的咪唑基; 7）色氨酸上的吲哚基其中

14、以氨基和羧基為最常用3、一般認(rèn)為共價(jià)法的特點(diǎn)如下： 酶和載體的結(jié)合比較牢固，酶不易脫落。故使用的半衰期較長。 制備條件復(fù)雜，反應(yīng)劇烈，易引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。 制備得到的固定化酶，活力回收一般在50%左右。 載體不會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性，經(jīng)得起一定的pH，濃度的改變。4、常用載體 天然高分子。如纖維素，葡聚糖凝膠（Sephadex），瓊脂糖（Agarose Sepharose），卡那膠，淀粉以及它們的衍生物。（利用-OH） 人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用-NH2） 無機(jī)載體，如多孔玻璃，硅膠等。（要加上一個(gè)基團(tuán)）5、 技術(shù)要點(diǎn) 將所選用的載體上的有

15、關(guān)基團(tuán)活化，然后和酶蛋白上有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。（直接活化或另接一反應(yīng)基團(tuán)） 在選用的載體上接上一個(gè)雙功能試劑，然后將酶蛋白和雙功能試劑偶聯(lián)。（接手臂）6、分類：重氮法； 疊氮法； 縮合法； 烷化反應(yīng)法； 硅烷化反應(yīng)法；溴化氰法。 重氮法目前在我們國內(nèi)用的較多的載體是對氨基苯磺酰乙基（ABSE）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等，用這些載體制備了不少固定化酶。方法原理如下： 用雙功能試劑 - 硫酸酯乙砜基苯胺（SESA），連接于被活化（-OH）的纖維素等載體上制備成ABSE-纖維素，瓊脂糖等。 在鹽酸和亞硝酸鈉處理下把ABSE-纖維素變成重氮鹽。 把酶偶聯(lián)于ABSE-纖維素上 疊氮法是在酶分子

16、與載體間形成肽鍵的固定化方法。主要是含羧基載體，轉(zhuǎn)變成?；B氮氯化物，異氰酸鹽等活化形態(tài)的衍生物，然后與酶的游離氨基反應(yīng)，從而形成肽鍵。例：用羧甲基纖維素疊氮衍生物制備固定化胰蛋白酶，步驟如下： 酯化：CM-纖維素依次用水、乙醇、乙醚洗滌干燥，然后懸于無水甲醇中，在冰浴中通入HCl 氣體，進(jìn)行酯化反應(yīng)；最后用甲醇、乙醚洗滌，空氣干燥。 肼解:把酯化后的CM-纖維素懸于甲醇中，再加入80%水合肼回流反應(yīng)1 小時(shí)，過濾，甲醇洗滌干燥。 疊氮化:肼解后的CM-纖維素（1g）加入150ml 2% HCl 在冰浴中混合，攪拌滴加9ml 3% NaNO2 反應(yīng)20min，過濾用冷蒸餾水洗滌，同時(shí)加酶，防止

17、戊二醛的另一醛再與載體上另一個(gè)-NH2 反應(yīng)。(4) 偶聯(lián)：經(jīng)疊氮化后的載體加入0.05N pH 8.0 磷酸緩沖液（內(nèi)含250-500mg 酶），5攪拌2-3 小時(shí)，過濾用 0.001N HCl，水洗滌，即為固定化胰蛋白酶（凍干保存） 縮合法（對含-NH2,-COOH 載體的另一種方法）主要利用具有羧基或氨基的載體，加入到酶液中，在縮合劑碳化二亞胺（雙環(huán)己基碳酰胺）作用下，使載體的羧基或氨基和酶蛋白上的NH2 或 COOH 形成肽鏈而被固定。含羧基的載體有羧甲基纖維素，羧甲基交聯(lián)葡聚糖等。含氨基的載體有氨乙基纖維素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物。 烷基化反應(yīng)法。將含有鹵素官能團(tuán)試劑與非水溶性的纖維

18、素載體進(jìn)行烷化反應(yīng)，然后和酶進(jìn)行偶聯(lián)制得固定化酶。一般常用三氯三嗪基試劑活化纖維素，然后偶聯(lián)酶（交聯(lián)葡聚糖，瓊脂糖，多孔玻璃等）。 硅烷化法：多孔玻璃特點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。耐有機(jī)溶劑和微生物破壞。載體可以再生，壽命長等。一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。這些多孔玻璃的孔徑在2501000 埃之間，含SiO2 96%，由于粒度很細(xì)，每1 克所擁有的表面積達(dá)100 平方米（氧化鈉，氧化硼，氧化硅經(jīng)熱處理原子重組而成，是優(yōu)良載體，但必須加以改造）。本法進(jìn)行酶的固定化可分三個(gè)步驟： 將本體接上一個(gè)結(jié)合劑（也即硅烷化）； 接上功能基團(tuán)； 把酶共價(jià)結(jié)合于載體。 溴化氰法-異脲鍵合法本方法主要用溴化

19、氰（CNBr）活化多糖類物質(zhì)。如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。上述這些載體在高pH 條件下（pH11 左右），溴化氰和多糖一類物質(zhì)形成一種環(huán)化的活潑的亞氨碳酸鹽，該化合物對蛋白質(zhì)上的NH2 反應(yīng)十分敏感，生成N-取代異脲，N-取代亞氨碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯。其中主要產(chǎn)物為N-取代異脲，反應(yīng)式如右：例：胰蛋白酶的固定-均在4時(shí)進(jìn)行。 活化：稱取瓊脂糖凝膠100mg（Sepharose 4B），用0.5M NaCl 和H2O 洗滌，除去保護(hù)劑和防腐劑，然后按1ml 沉淀

20、凝膠加入50300mgCNBr。立即用2N NaOH 調(diào)pH 值1011，維持pH 值11，pH 值不再下降，直到反應(yīng)終止。反應(yīng)在25通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)僅需10 分鐘，這樣CNBr 將載體全部活化，生成活潑的亞氨碳酸鹽。反應(yīng)完畢后，用冰水和冷0.1MpH9.5 NaHCO3 洗滌（注意：切忌用帶有-NH2 基的緩沖液來洗滌，因?yàn)閬啺碧妓猁}對NH2-敏感，在酶偶聯(lián)時(shí)，活性部位被NH2 占領(lǐng)，酶偶聯(lián)不上），去除多余CNBr 和雜蛋白。 偶聯(lián)：用偶聯(lián)緩沖液（0.025M pH 10.2 硼酸緩沖液-0.02M CaCl2 或NaHCO3 平衡洗滌，抽干，加入5ml 緩沖液（內(nèi)含16mg 酶）溫度降至

21、4，攪拌反應(yīng)4 小時(shí)，最后分別用0.1M pH8.5 硼酸緩沖液-1M NaCl 洗滌即成10.2M pH 4.0 醋酸緩沖液去除各種雜質(zhì)第三節(jié) 細(xì)胞的固定化方法一、 吸附法同酶的方法，（1）酵母細(xì)胞帶負(fù)電荷，在pH3-5的條件下能吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等載體表面，制成固定化細(xì)胞（2）霉菌的菌絲可吸附在多孔塑料、金屬絲網(wǎng)等載體上來固定化（3）植物細(xì)胞可吸附在中空纖維外壁上固定化（4）動(dòng)物細(xì)胞大多具有附壁生長特性，須依附在固體表面才能生長，可吸附在容器壁，微載體（顆粒細(xì)小的載體，直徑100-200um）和中空纖維外壁等載體上來固定（培養(yǎng)液在中空纖維內(nèi)流動(dòng)）。二、包埋法同酶包埋法例：海藻酸鈣-聚

22、賴氨酸（ALG-PLL）包埋技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞先用海藻酸鈣凝膠包埋聚賴氨酸處理，使膠粒外層包上一層聚賴氨酸薄膜檸檬酸鈉溶液處理，使海藻酸鈣凝膠溶解聚賴氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化 動(dòng)物細(xì)胞。三、 原生質(zhì)體固定化可解決胞內(nèi)酶的生產(chǎn)利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收一般采用凝膠包埋法包括原生質(zhì)體的制備和固定兩個(gè)步驟1 原生質(zhì)體的制備要求：保持膜的完整性，不能使細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)遭到破壞制備：對數(shù)期細(xì)胞的收集高滲溶液中加酶破壁分離除去細(xì)胞碎片、完整的細(xì)胞及酶（密度梯度離心）原生質(zhì)體2 原生質(zhì)體的固定原生質(zhì)體等滲緩沖液中配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液凝膠包埋角叉菜膠固定化 含滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液與角叉菜加熱溶解

23、配成3%-8%的凝膠滅菌冷卻到50左右與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混合均勻滴入到一定濃度的預(yù)冷的氯化鉀溶液中球狀的固定化原生質(zhì)體2 原生質(zhì)體的固定光交聯(lián)樹脂固定化法用含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液配制30%-60%濃度的光交聯(lián)樹脂預(yù)聚體，加熱溶解后，在50左右，加入1%光敏劑，與等體積的原生質(zhì)體懸浮液混合均勻，攤成薄層，經(jīng)紫外光照射2-3mm，聚合后切成一定形狀的小塊，制成片狀的固定化原生質(zhì)體。第四節(jié) 固定化酶的評價(jià) 一、相對酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值稱為相對酶活力,它與載體的體結(jié)構(gòu)、顆粒大小、底物分子量大小及酶的結(jié)合效率有關(guān)。相對酶活力低于75%的固定化酶,一般沒有

24、實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 二、酶的活力固定化的單位定義為：轉(zhuǎn)化底物的量/固定化酶的單位重量（單位面積）/單位時(shí)間,單位是：mol/mg(cm2)/min。將酶進(jìn)行固定化時(shí),總有一部分酶沒有與載體結(jié)合在一起,測定酶的活力回收率可以確定固定化的效果?；盍厥?固定化酶總活力/被固定化游離酶總活力×100%，或稱偶聯(lián)效率、活力保留百分?jǐn)?shù)。一般情況下,活力回收率應(yīng)小于1,若大于1,可能由于固定化活細(xì)胞增殖或某些抑制因素排除的結(jié)果。 三、固定化酶的半衰期 即固定化酶的活力下降為初始活力一半所經(jīng)歷的時(shí)間。它是衡量固定化酶操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵，其測定方法與化工催化劑半衰期的測定方法相似,也可

25、以通過長期實(shí)際操作,也可以通過較短時(shí)間的操作來推算。 第五節(jié) 固定化酶的性質(zhì)一、酶活力的變化 固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，專一性也可能發(fā)生變化，其原因可能是：酶的構(gòu)象的改變導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變；載體的存在給酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，影響酶與底物或其他效應(yīng)物的作用；底物和酶的作用受其擴(kuò)散速率的限制。在個(gè)別情況下，固定化酶由于抗抑能力的提高使得它反而比游離酶活力高。 二、酶穩(wěn)定性提高酶穩(wěn)定性包括熱穩(wěn)定性、對各種有機(jī)試劑的穩(wěn)定性、對pH的穩(wěn)定性、對蛋白水解酶的抗性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性等。三、最適pH值的變化 酶固定化后，催化底物的最適pH值和

26、pH活性曲線常發(fā)生變化，引起變化的因素主要有兩個(gè)1、載體帶電性質(zhì)：載體帶負(fù)電荷時(shí)，會(huì)吸引反應(yīng)液中的H+，致使酶附近反映區(qū)域pH比周圍反應(yīng)液低，須提高反應(yīng)液pH；反之，降低反應(yīng)液pH。第五節(jié) 固定化酶的性質(zhì)2、產(chǎn)物性質(zhì)：由于載體的擴(kuò)散障礙，產(chǎn)物為酸性時(shí)，產(chǎn)物積累在固定化酶所處的催化區(qū)域內(nèi)，使此區(qū)域的pH降低，須提高須提高周圍反應(yīng)液pH；反之，降低周圍反應(yīng)液pH。四、最適溫度的變化 一般情況下，固定化后的酶的最適作用溫度與游離酶差別不大，但有時(shí)由于固定化方法和載體的影響，固定化酶的最適作用溫度 可能降低，也可能升高，須加以注意，最適溫度提高是有利的，可以降低酶的失活速率。五、 動(dòng)力學(xué)常數(shù)

27、的變化(隨載體性質(zhì)變化)：由于分配效應(yīng)：=Si微環(huán)境/S宏觀環(huán)境對簡單的固定化酶系統(tǒng)，其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)一般服從米氏方程： 載體與底物帶相同電荷，Si<S,則<1,Km>Km 固定化酶降低了酶的親和力。 載體與底物電荷相反，靜電作用，Si>S，>1,Km<Km六、底物特異性：對于作用于小分子底物的酶，變化不明顯；但對于可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶來說，由于載體空間位阻作用，大分子底物難以接近酶分子而使催化速度大大降低，如固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對二肽或多肽作用保持不變，對酪蛋白的作用僅為游離酶的3% 左右。第六節(jié) 固定化輔酶一、 輔酶固定化的意義輔酶類物質(zhì)是一些“全酶”的組成成分，參與催化反應(yīng)。同時(shí)當(dāng)其與某些高分子物質(zhì)結(jié)合時(shí)，可以大大提高催化效率。因