阿司匹林聯(lián)合腦缺血預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注后炎性反應(yīng)的影響

1、阿司匹林聯(lián)合腦缺血預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注后炎性反應(yīng)的影響                         作者：廖仁昊 陳立英 梁容仙 王敬【摘要】 目的 探討阿司匹林（ASA)聯(lián)合腦缺血預(yù)處理治療對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。方法 SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、腦缺血預(yù)處理組和ASA治療組。各組采用ZeaLonga等的大腦中動脈線

2、栓法并加以改進，制備缺血預(yù)處理及缺血再灌注損傷實驗動物模型。在相應(yīng)時間點比較各組神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死體積、血清神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)含量及腦組織白細胞介素(IL)1和腫瘤壞死因子(TNF)含量。結(jié)果 ASA聯(lián)合腦缺血預(yù)處理可使神經(jīng)功能缺損減輕、腦梗死體積縮小、血清NSE含量降低，均較缺血預(yù)處理組更為明顯。腦組織IL1和TNF含量降低亦更為明顯。結(jié)論 ASA可增強缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受作用，下調(diào)腦組織再灌注損傷時IL1和TNF的表達，二者具有疊加作用。 【關(guān)鍵詞】 阿司匹林； 腦缺血預(yù)處理； 白細胞介素1； 腫瘤壞死因子近年來發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予短暫的腦缺血預(yù)處理(BIP)可誘導(dǎo)缺血耐受(IT

3、)1，從而減輕缺血再灌注所致的腦損傷。腦缺血再灌注后的炎癥級聯(lián)反應(yīng)是神經(jīng)元損傷的重要因素，抗感染治療可減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷2。阿司匹林（ASA）具有抗炎、抗血小板聚集等作用，是防治缺血性腦血管疾病的重要藥物之一。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，ASA除有抗血栓形成作用外，還有直接的腦保護作用3，但對IT影響的報道尚少見。本實驗利用局灶缺血預(yù)處理模型，觀察ASA對大鼠BIP后缺血再灌注損傷保護作用的影響。1 材料與方法1.1 實驗動物選用健康雄性SD大鼠120只，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體重250320 g，隨機分為4組：假手術(shù)組(n=40)；腦缺血再灌注組，假手術(shù)3 d后給予2 h大腦中動脈

4、閉塞(MCAO)，按再灌注時間分4個亞組（B1B4），即缺血2 h后分別再灌注6、12、24、48 h，每個亞組動物均為10只；BIP組，缺血預(yù)處理10 min，再灌注3 d后給予2 h MCAO；ASA治療組，于缺血預(yù)處理10 min即開始給藥，ASA 60 mg·kg-1·d-1溶于2 ml生理鹽水中，灌胃，3 d后再次造成2 h MCAO。BIP組和ASA治療組均按缺血2 h后分別再灌注6、24 h分為2個亞組，每個亞組動物均為10只。腦缺血再灌注組和BIP組予等量生理鹽水灌胃。1.2 缺血預(yù)處理及缺血再灌注模型制作采用文獻4法并加以改進。再灌注3 d后用相同方法再次

5、造成MCAO 2 h，于各相應(yīng)時間點進行神經(jīng)功能缺失評分，心臟取血，后斷頭處死。以動物清醒后爬行時向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)，嚴重時向右跌倒，提尾時右前肢內(nèi)收屈曲，且一直存活到規(guī)定時間點為造模成功標志。假手術(shù)僅暴露頸總動脈及分叉處，不插線阻斷大腦中動脈。各組動物術(shù)中均用白熾燈使其肛溫維持在37左右。1.3 指標檢測及方法按Longa等4的5級評分法評分：0級，無功能障礙；1級,不能伸展右側(cè)前肢；2級，向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3級，向右側(cè)傾倒；4級，無自主活動伴意識喪失。神經(jīng)功能缺失評分完畢后，取心臟血2 ml，離心后取血清，置-20冰箱內(nèi)保存，整批待測。三苯基氯化四氮唑溶液(37)中染色30 min，然后用10

6、%的甲醛緩沖液固定。24 h后照相測每個層面梗死灶面積，將各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死體積。1(IL1)、腫瘤壞死因子(TNF)含量測定                             每組另外5只動物用10%的水合氯醛深麻醉后處死，迅速取出鼠腦，剝離左側(cè)皮質(zhì)，稱重后按400 mg1 ml加

7、生理鹽水制腦組織勻漿，勻漿液3 000 r/min低溫離心15 min，取上清液置-20冰箱內(nèi)待測。后采用FTDF晶體閃爍計數(shù)儀(北京核儀器廠生產(chǎn))，測定腦組織IL1和TNF的含量。試劑盒均由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供。1.4 統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理，多組比較進行方差分析及兩兩比較q檢驗，兩組間比較采用t或t檢驗。2 結(jié)果2.1 神經(jīng)功能缺失評分假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。BIP組、ASA治療組神經(jīng)功能缺失評分與相應(yīng)時間點的缺血再灌注組比較有顯著性差異(P<0.01)。ASA治療組神經(jīng)功能缺失評分明顯降低，與BIP組比較差異顯著(P&

8、lt;0.01)，見表1。表1 各組腦缺血再灌注后不同時間點神經(jīng)功能缺失評分的比較(略)2.2 血清NSE含量腦缺血再灌注組各個時間點血清NSE含量，與相應(yīng)時間點的假手術(shù)組比較明顯升高(P<0.05)。BIP組、ASA治療組與相應(yīng)時間點的腦缺血再灌注組比較血清NSE含量降低(P<0.01)。ASA治療組與BIP組比較血清NSE含量降低(P<0.01)，見表2。2.3 腦梗死體積假手術(shù)組無肉眼可見的梗死灶形成。腦缺血再灌注組梗死體積6 h為(175.78±19.33) mm3，24 h為(179.37±16.96) mm3。BIP組梗死體積6 h為(96.1

9、5±21.16) mm3，24 h為(99.36±18.95) mm3。ASA治療組梗死體積6 h為(63.55±17.56) mm3，24 h為(67.44±23.04) mm3。BIP組、ASA治療組與相應(yīng)時間點的腦缺血再灌注組比較梗死體積明顯縮小(P<0.01)。ASA治療組與BIP組比較梗死體積縮小更加明顯(P<0.05)。表2 各組腦缺血再灌注后不同時間點血清NSE含量的比較(略)2.4 腦組織IL1和TNF含量腦缺血再灌注6 h病變側(cè)腦組織IL1和TNF含量達到高峰，之后略有下降。腦缺血再灌注組各個時間點腦組織IL1和TNF含量較

10、假手術(shù)組明顯增高(P<0.01)。BIP組、ASA治療組與相應(yīng)時間點的腦缺血再灌注組比較病變側(cè)腦組織IL1和TNF含量降低，并有顯著性差異(P<0.05)。ASA治療組與BIP組比較病變側(cè)腦組織IL1和TNF含量降低(P<0.05)，見表3。表3 各組腦缺血再灌注后不同時間點腦組織IL1、TNF含量的比較(略)3 討論 腦缺血后的再灌注往往引起較缺血本身更為嚴重的損害。再灌注損傷的病理特征主要為中性粒細胞浸潤。在某些動物實驗中應(yīng)用抗中性粒細胞抗體使中性粒細胞減少，能使受損部位的面積縮小，提示在再灌注損傷中，中性粒細胞為主要的介導(dǎo)因素，各種炎癥因子的釋放起著重要的作用5。腦缺血

11、再灌注后，損傷區(qū)內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元、星形細胞和血管周圍的炎性細胞即被激活，通過釋放兩種關(guān)鍵的細胞因子(IL1和TNF)而觸發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷6。IL1、TNF作為炎癥反應(yīng)的起始因子，檢測其含量對衡量腦缺血再灌注損傷有重要意義。本次實驗結(jié)果與相關(guān)報道一致7，表明IL1、TNF參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生，在腦缺血性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起一定的作用。 近年來發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予短暫的BIP可誘導(dǎo)IT1，激活內(nèi)源性神經(jīng)保護機制，抑制缺血后的炎癥反應(yīng)，從而減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷。本次實驗我們發(fā)現(xiàn)，提前給予BIP可以使再次缺血時神經(jīng)功能缺失減輕，梗死體積縮小。從而證實了BIP所誘導(dǎo)的IT現(xiàn)象的存在

12、。并且還發(fā)現(xiàn)提前給予BIP可以使再次缺血時血清NSE含量下降，而NSE是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的敏感性和特異性標志，提示BIP對大鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)BIP可減輕再次缺血時IL1、TNF的表達，對缺血再灌注產(chǎn)生保護作用，最終減輕組織學損害。                             

13、業(yè)已證實，炎癥反應(yīng)可能在缺血再灌注損傷及腦IT中具有重要意義,抗感染治療可減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷7。近年來隨著對ASA研究的深入，越來越多的實驗證明其有神經(jīng)保護作用，抑制缺血后的炎癥反應(yīng)，從而減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷3。本實驗我們發(fā)現(xiàn)，ASA可能對BIP誘導(dǎo)的IT有一定的增強作用，二者對腦缺血再灌注損傷IL1和TNF的表達下調(diào)可能具有疊加的促進作用，進一步從分子水平提示抗感染治療可增強BIP所誘導(dǎo)的IT，二者具有疊加效應(yīng)。ASA增強IT的機制尚不明確，可能與其能有效地阻止前炎性細胞因子過量表達及其生物學作用的發(fā)揮，減少缺血區(qū)白細胞滲出與浸潤，減輕缺血后炎癥反應(yīng)有關(guān)。盡管本研究初步表明

14、在缺血預(yù)處理的基礎(chǔ)上給予ASA治療，可能增強IT，但在臨床上應(yīng)用抗炎治療是否能增強短暫性腦缺血發(fā)作后機體的內(nèi)源性腦保護作用，尚有待進一步研究。【參考文獻】 1 Masada T，Hua Y，Xi G，et al.Attenuation of ischemic brain edema and cerebrovascular injury after ischemic preconditioning in the ratJ.J Cereb Blood Flow Metab，2001；21(1):2233.2 Zaremba J，Skrobanski P，Losy J.Tumour necrosis

15、 factoralpha is increased in the cerebrospinal fluid and serum of ischaemic stroke patients and correlates with the volume of evolving brain infarctJ.Biomed Pharmacother，2001；55(2)：25867.3 Khayyam N,Thavendirinathan P,Carmichael FJ,et al.Neuroprotective effects of acetylsalicylic acid in an animal m

16、odel of focal brain ischemiaJ.Neuroreport,1999;10(2)：3714.4 Longa EZ，Weinstein PR，Carson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without crainietomy in ratsJ.Stroke，1989;20(1):8491.5 Liao SL，Chen WY，Raung SL,et al.Association of immune responses and ischemic brain infarction in ratJ.Neuroreport，2001；12(9):19437.6 Wang X，Barone FC，Aiyar NV,et al.Interleukin1 receptor and receptor antagonist gene exp