阿司匹林聯(lián)合腦缺血預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注后炎性反應(yīng)的影響

1、阿司匹林聯(lián)合腦缺血預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注后炎性反應(yīng)的影響                         作者：廖仁昊 陳立英 梁容仙 王敬【摘要】 目的 探討阿司匹林（ASA)聯(lián)合腦缺血預(yù)處理治療對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、腦缺血預(yù)處理組和ASA治療組。各組采用ZeaLonga等的大腦中動(dòng)脈線(xiàn)

2、栓法并加以改進(jìn)，制備缺血預(yù)處理及缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較各組神經(jīng)功能缺失評(píng)分、腦梗死體積、血清神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)含量及腦組織白細(xì)胞介素(IL)1和腫瘤壞死因子(TNF)含量。結(jié)果 ASA聯(lián)合腦缺血預(yù)處理可使神經(jīng)功能缺損減輕、腦梗死體積縮小、血清NSE含量降低，均較缺血預(yù)處理組更為明顯。腦組織IL1和TNF含量降低亦更為明顯。結(jié)論 ASA可增強(qiáng)缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受作用，下調(diào)腦組織再灌注損傷時(shí)IL1和TNF的表達(dá)，二者具有疊加作用。 【關(guān)鍵詞】 阿司匹林； 腦缺血預(yù)處理； 白細(xì)胞介素1； 腫瘤壞死因子近年來(lái)發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予短暫的腦缺血預(yù)處理(BIP)可誘導(dǎo)缺血耐受(IT

3、)1，從而減輕缺血再灌注所致的腦損傷。腦缺血再灌注后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是神經(jīng)元損傷的重要因素，抗感染治療可減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷2。阿司匹林（ASA）具有抗炎、抗血小板聚集等作用，是防治缺血性腦血管疾病的重要藥物之一。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ASA除有抗血栓形成作用外，還有直接的腦保護(hù)作用3，但對(duì)IT影響的報(bào)道尚少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)利用局灶缺血預(yù)處理模型，觀(guān)察ASA對(duì)大鼠BIP后缺血再灌注損傷保護(hù)作用的影響。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康雄性SD大鼠120只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重250320 g，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(n=40)；腦缺血再灌注組，假手術(shù)3 d后給予2 h大腦中動(dòng)脈

4、閉塞(MCAO)，按再灌注時(shí)間分4個(gè)亞組（B1B4），即缺血2 h后分別再灌注6、12、24、48 h，每個(gè)亞組動(dòng)物均為10只；BIP組，缺血預(yù)處理10 min，再灌注3 d后給予2 h MCAO；ASA治療組，于缺血預(yù)處理10 min即開(kāi)始給藥，ASA 60 mg·kg-1·d-1溶于2 ml生理鹽水中，灌胃，3 d后再次造成2 h MCAO。BIP組和ASA治療組均按缺血2 h后分別再灌注6、24 h分為2個(gè)亞組，每個(gè)亞組動(dòng)物均為10只。腦缺血再灌注組和BIP組予等量生理鹽水灌胃。1.2 缺血預(yù)處理及缺血再灌注模型制作采用文獻(xiàn)4法并加以改進(jìn)。再灌注3 d后用相同方法再次

5、造成MCAO 2 h，于各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分，心臟取血，后斷頭處死。以動(dòng)物清醒后爬行時(shí)向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)，嚴(yán)重時(shí)向右跌倒，提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲，且一直存活到規(guī)定時(shí)間點(diǎn)為造模成功標(biāo)志。假手術(shù)僅暴露頸總動(dòng)脈及分叉處，不插線(xiàn)阻斷大腦中動(dòng)脈。各組動(dòng)物術(shù)中均用白熾燈使其肛溫維持在37左右。1.3 指標(biāo)檢測(cè)及方法按Longa等4的5級(jí)評(píng)分法評(píng)分：0級(jí)，無(wú)功能障礙；1級(jí),不能伸展右側(cè)前肢；2級(jí)，向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3級(jí)，向右側(cè)傾倒；4級(jí)，無(wú)自主活動(dòng)伴意識(shí)喪失。神經(jīng)功能缺失評(píng)分完畢后，取心臟血2 ml，離心后取血清，置-20冰箱內(nèi)保存，整批待測(cè)。三苯基氯化四氮唑溶液(37)中染色30 min，然后用10

6、%的甲醛緩沖液固定。24 h后照相測(cè)每個(gè)層面梗死灶面積，將各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死體積。1(IL1)、腫瘤壞死因子(TNF)含量測(cè)定                             每組另外5只動(dòng)物用10%的水合氯醛深麻醉后處死，迅速取出鼠腦，剝離左側(cè)皮質(zhì)，稱(chēng)重后按400 mg1 ml加

7、生理鹽水制腦組織勻漿，勻漿液3 000 r/min低溫離心15 min，取上清液置-20冰箱內(nèi)待測(cè)。后采用FTDF晶體閃爍計(jì)數(shù)儀(北京核儀器廠(chǎng)生產(chǎn))，測(cè)定腦組織IL1和TNF的含量。試劑盒均由解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所提供。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組比較進(jìn)行方差分析及兩兩比較q檢驗(yàn)，兩組間比較采用t或t檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 神經(jīng)功能缺失評(píng)分假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。BIP組、ASA治療組神經(jīng)功能缺失評(píng)分與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的缺血再灌注組比較有顯著性差異(P<0.01)。ASA治療組神經(jīng)功能缺失評(píng)分明顯降低，與BIP組比較差異顯著(P&

8、lt;0.01)，見(jiàn)表1。表1 各組腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺失評(píng)分的比較(略)2.2 血清NSE含量腦缺血再灌注組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清NSE含量，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組比較明顯升高(P<0.05)。BIP組、ASA治療組與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的腦缺血再灌注組比較血清NSE含量降低(P<0.01)。ASA治療組與BIP組比較血清NSE含量降低(P<0.01)，見(jiàn)表2。2.3 腦梗死體積假手術(shù)組無(wú)肉眼可見(jiàn)的梗死灶形成。腦缺血再灌注組梗死體積6 h為(175.78±19.33) mm3，24 h為(179.37±16.96) mm3。BIP組梗死體積6 h為(96.1

9、5±21.16) mm3，24 h為(99.36±18.95) mm3。ASA治療組梗死體積6 h為(63.55±17.56) mm3，24 h為(67.44±23.04) mm3。BIP組、ASA治療組與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的腦缺血再灌注組比較梗死體積明顯縮小(P<0.01)。ASA治療組與BIP組比較梗死體積縮小更加明顯(P<0.05)。表2 各組腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)血清NSE含量的比較(略)2.4 腦組織IL1和TNF含量腦缺血再灌注6 h病變側(cè)腦組織IL1和TNF含量達(dá)到高峰，之后略有下降。腦缺血再灌注組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織IL1和TNF含量較

10、假手術(shù)組明顯增高(P<0.01)。BIP組、ASA治療組與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的腦缺血再灌注組比較病變側(cè)腦組織IL1和TNF含量降低，并有顯著性差異(P<0.05)。ASA治療組與BIP組比較病變側(cè)腦組織IL1和TNF含量降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。表3 各組腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織IL1、TNF含量的比較(略)3 討論 腦缺血后的再灌注往往引起較缺血本身更為嚴(yán)重的損害。再灌注損傷的病理特征主要為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。在某些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用抗中性粒細(xì)胞抗體使中性粒細(xì)胞減少，能使受損部位的面積縮小，提示在再灌注損傷中，中性粒細(xì)胞為主要的介導(dǎo)因素，各種炎癥因子的釋放起著重要的作用5。腦缺血

11、再灌注后，損傷區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、星形細(xì)胞和血管周?chē)难仔约?xì)胞即被激活，通過(guò)釋放兩種關(guān)鍵的細(xì)胞因子(IL1和TNF)而觸發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷6。IL1、TNF作為炎癥反應(yīng)的起始因子，檢測(cè)其含量對(duì)衡量腦缺血再灌注損傷有重要意義。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致7，表明IL1、TNF參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生，在腦缺血性疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起一定的作用。 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予短暫的BIP可誘導(dǎo)IT1，激活內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，抑制缺血后的炎癥反應(yīng)，從而減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷。本次實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，提前給予BIP可以使再次缺血時(shí)神經(jīng)功能缺失減輕，梗死體積縮小。從而證實(shí)了BIP所誘導(dǎo)的IT現(xiàn)象的存在

12、。并且還發(fā)現(xiàn)提前給予BIP可以使再次缺血時(shí)血清NSE含量下降，而NSE是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的敏感性和特異性標(biāo)志，提示BIP對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)BIP可減輕再次缺血時(shí)IL1、TNF的表達(dá)，對(duì)缺血再灌注產(chǎn)生保護(hù)作用，最終減輕組織學(xué)損害。                             

13、業(yè)已證實(shí)，炎癥反應(yīng)可能在缺血再灌注損傷及腦IT中具有重要意義,抗感染治療可減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷7。近年來(lái)隨著對(duì)ASA研究的深入，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明其有神經(jīng)保護(hù)作用，抑制缺血后的炎癥反應(yīng)，從而減輕缺血再灌注所致的神經(jīng)損傷3。本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，ASA可能對(duì)BIP誘導(dǎo)的IT有一定的增強(qiáng)作用，二者對(duì)腦缺血再灌注損傷IL1和TNF的表達(dá)下調(diào)可能具有疊加的促進(jìn)作用，進(jìn)一步從分子水平提示抗感染治療可增強(qiáng)BIP所誘導(dǎo)的IT，二者具有疊加效應(yīng)。ASA增強(qiáng)IT的機(jī)制尚不明確，可能與其能有效地阻止前炎性細(xì)胞因子過(guò)量表達(dá)及其生物學(xué)作用的發(fā)揮，減少缺血區(qū)白細(xì)胞滲出與浸潤(rùn)，減輕缺血后炎癥反應(yīng)有關(guān)。盡管本研究初步表明

14、在缺血預(yù)處理的基礎(chǔ)上給予ASA治療，可能增強(qiáng)IT，但在臨床上應(yīng)用抗炎治療是否能增強(qiáng)短暫性腦缺血發(fā)作后機(jī)體的內(nèi)源性腦保護(hù)作用，尚有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Masada T，Hua Y，Xi G，et al.Attenuation of ischemic brain edema and cerebrovascular injury after ischemic preconditioning in the ratJ.J Cereb Blood Flow Metab，2001；21(1):2233.2 Zaremba J，Skrobanski P，Losy J.Tumour necrosis

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