細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法驗證

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法驗證方案一般內(nèi)毒素的驗證包括：1 鱟試劑靈敏度的驗證， 目的是復(fù)核鱟試劑的靈敏度，如果使用國家標(biāo)準(zhǔn)品，必須與USP標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行確認(rèn)2 干擾實驗，衡量樣品是否有干擾，將標(biāo)準(zhǔn)品加入到樣品溶液中系列樣品加入鱟試劑是否有影響將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)加入不同樣品濃度3 樣品測試稀釋輩數(shù)的確認(rèn)4 結(jié)果判斷起 草 人 起草日期 審 核 人 審核日期 批 準(zhǔn) 人 批準(zhǔn)日期 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法驗證方案目的-范圍-責(zé)任人-內(nèi)容-1.實驗材料及用具-2 實驗準(zhǔn)備-3.具體驗證步驟-3.1. 鱟試劑靈敏度復(fù)核-3.2.干擾實驗-3.3.供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查-4. 驗證結(jié)論-附：表1.鱟試劑靈敏度復(fù)核記錄表2. 干

2、擾試驗記錄表3.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查記錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法驗證方案目的：為確保鹽酸羅哌卡因一水合物細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法的專屬性、靈敏度，保證檢測結(jié)果可符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，特制定此方案。范圍：鹽酸羅哌卡因一水合物細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法責(zé)任人：細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗員、QC主管內(nèi)容：1.實驗材料及用具1.1. 電子天平1.2. 電熱干燥箱1.3. 恒溫水浴箱1.4.水銀溫度計1.5. 旋渦混合器1.6. 鱟試劑應(yīng)提供供應(yīng)商，批號，規(guī)格等信息（具有國家主管部門的批準(zhǔn)文號）1.7.細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品如果使用國家標(biāo)準(zhǔn)品，必須增加國家標(biāo)準(zhǔn)品與USP標(biāo)準(zhǔn)品的對應(yīng)變化確認(rèn)，即他們具有相同的變化趨勢(由中國藥品生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)

3、放的標(biāo)準(zhǔn)品)1.8.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1.9. 實驗用具:移液管、凝集管、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、時鐘、75%酒精棉、剪刀、砂輪。2 實驗準(zhǔn)備2.1. 玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱。2.2. 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻璃器皿置烤箱后，將烤箱調(diào)至250，待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開始計時，干烤至少1 小時。達(dá)到規(guī)定時間后，關(guān)斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開金屬容器的情況下，可在

4、兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則須再次干烤除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。3.具體驗證步驟3.1. 鱟試劑靈敏度復(fù)核 實驗操作細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備USP和CP標(biāo)準(zhǔn)的等效性取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按照標(biāo)準(zhǔn)品說明書，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進(jìn)行稀釋，制備成4個濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即2、0.5、0.25（為所復(fù)核的鱟試對的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器

5、上混合30 秒鐘。待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/ 支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml 檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。加樣將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4 支（管）4 列每列每支分別加入0.1ml 的2、0.5、和0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水。加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入37±1水浴或適宜恒溫器中，試管架

6、保持水平狀態(tài)，保溫60±2 分鐘。 觀察并記錄結(jié)果。將試管架從水浴中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180°觀察，管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；未形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（） 實驗結(jié)果計算如最大濃度2.04管均為陽性，最低濃度0.254管均為陰性，陰性對照為陰性時實驗為有效，按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（c）。 c = lg-1 (X/4)式中x為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。結(jié)果判斷當(dāng)c在0.52（包括0

7、.5和2）時判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，可用于干擾實驗和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以（標(biāo)示靈敏度）為該批鱟試劑的靈敏度。 3.2.干擾實驗 操作方法制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2、0.5、0.25（方法同）。制備含內(nèi)毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預(yù)實驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將中的同支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個濃度即2、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支，輕彈壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml

8、檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。加樣將準(zhǔn)備好的鱟試劑取其中18支（管）放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。將另外18支（管）鱟試劑放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的含2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素的供試品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對照。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放

9、入37±1水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。實驗結(jié)果計算如兩組最大濃度2.0均為陽性，最低濃度0.25均為陰性，陰性對照, 管均為陰性時，按下式計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Es)和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Et).Es= lg-1 (Xs/4)Et= lg-1 (Xt/4)Xs、Xt分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。結(jié)果判斷當(dāng)Es在0.52.0（包括0.5和2.0）時，且Et在0.5 Es2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）時

10、，則認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實驗，可在該濃度下對此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。當(dāng)Et不在0.5 Es2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）時，則認(rèn)為供試品在該濃度下干擾實驗。 。3.3.供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照，同時每次實驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照。操作方法供試品溶液的制備：（稀釋倍數(shù)不得超過MVD） 陽性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（方法同）。供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。（方法同 供試品陽性對照溶液的制備）。陰性對

11、照液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。加樣取8支（管）溶解好的鱟試劑，其中2支加入0.1ml供試品溶液或其稀釋液（其稀釋倍數(shù)不得超過MVD需要提供具體稀釋要求）作為供試品管，2支加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對照管（PC），2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管（NC），2支加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管（PPC）。將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直

12、放入37±1水浴或適宜恒溫器中，保溫60±2分鐘。保溫和取放試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。 結(jié)果判斷當(dāng)陽性對照都為陽性、供試品陽性對照都為陽性且陰性對照都為陰性時，實驗有效。若供試品2管均為陰性，認(rèn)為該供試品符合規(guī)定；如供試品2 管均為陽性，應(yīng)認(rèn)為不符合規(guī)定；如2 管中1管為陽性，1 管為陰性，按上述方法另取4支供試品管復(fù)試，4管中如有1管為陽性，即認(rèn)為不符合規(guī)定。若第一次實驗時供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而結(jié)果出現(xiàn)2 管均為陽性或2管中1管為陽性時，按同樣方法復(fù)試，復(fù)試時要求將其稀釋至MVD。 4.驗證結(jié)論 附：表1鱟試劑靈敏度復(fù)核記錄檢驗?zāi)康臋z驗日期檢驗依據(jù)室溫試

13、劑名稱生產(chǎn)單位批號靈敏度/效價規(guī)格鱟試劑EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品EU/支細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水實驗操作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：反應(yīng)結(jié)果保溫時間（ ）內(nèi)毒素濃度EU/ml2 0.5 0.25（ ）（ ）（ ） （ ）陰性對照終點濃度結(jié)果計算結(jié)果判斷檢驗人員校對人員表2干擾試驗記錄檢品名稱檢驗日期生產(chǎn)單位室溫供樣單位規(guī)格批號包裝檢驗依據(jù)內(nèi)毒素限度試劑名稱生產(chǎn)單位批號靈敏度/效價規(guī)格鱟試劑EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品EU/支細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水實驗操作1.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：2. 供試品制備：3. 含供試品內(nèi)毒素溶液的制備：反應(yīng)結(jié)果保溫時間（ ）內(nèi)毒素濃度EU/ml2 0.5 0.25（ ）（ ）（ ） （ ）陰性對照終點濃度重1標(biāo)準(zhǔn)復(fù)2對照管3數(shù)4重1含供試品