特定結(jié)合分子固定化表面對(duì)於內(nèi)毒素吸附行為之評(píng)估

1、特定結(jié)合分子固定化表面對(duì)於內(nèi)毒素吸附行為之評(píng)估An assessment on specific-binding ligand immobilized surface for endotoxin adsorption 陳秀綾老師 國立瑞芳高級(jí)工業(yè)職業(yè)學(xué)校 3中文摘要本研究擬探討不同特定結(jié)合分子固定化表面與細(xì)菌內(nèi)毒素彼此間特異性吸附的行為。研究中將探討普遍使用於敗血癥治療時(shí)所使用的抗生素與內(nèi)毒素分子之作用，利用表面電漿共振(SPR)之流動(dòng)吸附系統(tǒng)線上偵測(cè)其彼此間專一性動(dòng)態(tài)吸附行為, 並將吸附實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行與理論模型分析，進(jìn)一步計(jì)算平衡與動(dòng)態(tài)參數(shù)。SPR晶片表面將搭配以橢圓儀、接觸角量測(cè)儀測(cè)定表

2、面膜厚及親疏水性質(zhì)、FTIR或ESCA量測(cè)修飾表面之官能基與分佈狀況來進(jìn)行固定化表面之定性測(cè)試,及評(píng)估不同抗生素對(duì)於移除細(xì)菌內(nèi)毒素之效能評(píng)估。初步測(cè)試SPR系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)吸附金面的清洗實(shí)驗(yàn)，結(jié)果確定以0.5% SDS界面活性清洗劑流過晶面並無法徹底清除吸附在金面之HAS分子。未來工作將進(jìn)行內(nèi)毒素與抗生素固定化表面分別對(duì)於對(duì)應(yīng)分子間特異性吸附之行為進(jìn)行研究探討，進(jìn)而評(píng)估篩選較適合用於作為發(fā)展體外血液灌注處理器之表面固定化抗生素分子。關(guān)鍵詞：內(nèi)毒素；特異性吸附；表面修飾；抗生素AbstractVarious specific-binding ligand immobilized surfaces

3、for the performance of endotoxin adsorption will be evaluated in this study. The interaction between endotoxin and antibiotics generally used in treating sepsis will be studied. A flow system with Surface Plasmon Resonance (SPR) is used to monitor the dynamic behavior of this specific adsorption. Ex

4、perimental data of SPR are fitted to theoretical model to determine the equilibrium binding, dynamic dissociation, and association constants. Accompanied with the thickness measurement of binding molecules via ellipsometry, hydrophilicity characterization by contact angle measurement, and the presen

5、ce of specific functional group or chemical compositions by FTIR or ESCA, the capability of specific antibiotics on the removal of endotoxin are evaluated. Preliminary tests focused on evaluating cleanness methods for Human Albumin adsorbed surfaces and found that by purging with a 0.5% SDS surfacta

6、nt solution cannot thoroughly remove the adsorbed protein from the surface. In the next, we shall study the adsorption behavior of antibiotics to endotoxin immobilized surface, and the adsorption behaviors of endotoxin to antibiotics immobilized surface as well. The specific binding behaviors betwee

7、n endotoxin with preferred antibiotics shall be further evaluated for the development of an antibiotics immobilized extracorporeal hemoperfusion device.Keywords: endotoxin, specific adsorption, surface modification, antibiotics.前言 雖然近來在手術(shù)技巧、重病特別護(hù)理、以及多樣抗生素的便利取得上，已有長足之進(jìn)步。然而敗血病以及嚴(yán)重的敗血性休克卻仍是已開發(fā)國家中重癥病患的主

8、要死亡原因之一，其死亡率更有可能高達(dá)50%以上 1。來自格蘭氏陰菌細(xì)胞壁所釋放出來的內(nèi)毒素(Endotoxin)在此致病的機(jī)轉(zhuǎn)中扮演了一個(gè)重要的角色2, 3；因此，越來越多研究的目的是著眼於建立與內(nèi)毒素分子具有高特異性結(jié)合能力分子的固定化的表面，藉著直接透過血液灌注的方式在病人體外透過吸附的方式來移除此重要的致病毒素，進(jìn)而達(dá)到治療的成效。目前已在日本臨床上使用的Toraymyxin就是透過Polymyxin B分子的固定化來達(dá)成上述的效果。因此，文獻(xiàn)上仍有許多其他候選分子持續(xù)地被研究評(píng)估當(dāng)中 5。然而，Toraymyxin的臨床評(píng)估報(bào)告卻顯示，受試者的存活率與殘留在血液中內(nèi)毒素的濃度卻往往具有

9、一定程度的差異性4。本研究希望透過探討與內(nèi)毒素具有特異性結(jié)合能力的分子其靜動(dòng)態(tài)吸脫附行為的檢測(cè)，來分析求得其作用之熱力學(xué)平衡與動(dòng)態(tài)吸附參數(shù)值。最終目的希望可作為用來發(fā)展一具有針對(duì)於內(nèi)毒素較高普遍使用性裝置之參考。實(shí)驗(yàn)方法與工具 本研究主要包括：（一）LPS與抗生素之表面固定化，（二）固定化表面定性，（三）LPS及抗生素分子吸附性及（四）吸附參數(shù)理論分析等四部分工作。在分子固定化之實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)上，大致分為兩部分，分別為（一）細(xì)菌內(nèi)毒素的表面固定化與（二）抗生素固定化表面的吸附實(shí)驗(yàn)：在第一個(gè)階段我們將把內(nèi)毒素固定在抗非特異性吸附的SAM上，進(jìn)行初步的抗生素的篩選。實(shí)驗(yàn)的過程中，利用接觸角的量測(cè)可以試

10、著判別內(nèi)毒素分子在表面固定方位，使用表面官能集團(tuán)與膜層的測(cè)量可以確定成膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，並可進(jìn)一步判別下一階段所選定的抗生素可用於表面固定化的官能集團(tuán)，以避免影響與內(nèi)毒素間的特異性吸附行為。此實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)將建構(gòu)在一個(gè)以雙硫鍵結(jié)來固定內(nèi)毒素的表面，目的是希望可以產(chǎn)生一個(gè)可以重新固定內(nèi)毒素的新表面，不受到先前吸附實(shí)驗(yàn)殘餘的影響。內(nèi)毒素的表面吸附量將以SPR的訊號(hào)來判定表面的固定情況。實(shí)驗(yàn)將對(duì)於經(jīng)固定化處理之表面進(jìn)行各種定性測(cè)試，其中包括以橢圓儀進(jìn)行膜厚的量測(cè)、以接觸角量測(cè)來定量表面的親疏水性質(zhì)並且搭配FTIR或ESCA的量測(cè)來偵測(cè)表面之官能基與膜層之組成成分?？股毓潭ɑ砻娴奈綄?shí)驗(yàn)將直接模擬體外血液

11、灌注移除內(nèi)毒素的系統(tǒng)。同樣以前一階段所述的各種表面定性方式來確定成膜分子的排列情況，並搭配橢圓儀量測(cè)膜厚的方式來定量抗生素於SAM表面以共價(jià)性鍵結(jié)固定的情況，用以定量抗生素與SAM膜的表面結(jié)合比率。 SPR所量測(cè)到的訊號(hào)變化首先將代入Langmuir model來進(jìn)行與理論模型彼此間合適情況的探討，用來決定內(nèi)毒素分子與所選定抗生素間(a)平衡參數(shù)(Kd)(b)動(dòng)態(tài)脫附參數(shù)(Koff)和(c)動(dòng)態(tài)吸附參數(shù)(Kon)的計(jì)算與進(jìn)一步配合上述表面的定性測(cè)試來探求彼此間的結(jié)合狀況，並同時(shí)參考Biacore系統(tǒng)本身所附的BIAevaluation套專軟體進(jìn)行上述平衡與動(dòng)態(tài)參數(shù)的求得，抑或進(jìn)行更一步理論模型

12、複雜化的修訂，來求得最合適描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果理論模型的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。初步結(jié)果SPR系統(tǒng)測(cè)試(圖一)，主要是想利用線上進(jìn)行人類白蛋白吸附金表面的線上清洗，測(cè)試儀器中心內(nèi)BiacoreX系統(tǒng)的操作穩(wěn)定性，亦同時(shí)評(píng)估吸附蛋白質(zhì)的脫附行為來得知線上清洗晶片的可行性。測(cè)試上分為蛋白質(zhì)短暫吸附(a)與使其在界面停滯一段時(shí)間(b)在金表面上兩個(gè)部分，後者實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的是用來模擬已長時(shí)間未經(jīng)清洗的蛋白質(zhì)吸附表面。從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看來，無論(a)和(b)兩個(gè)部分都無法使得訊號(hào)在清洗過後回到基準(zhǔn)線(baseline)，金表面所具備相當(dāng)大的表面能，仍使得吸附在金表面的蛋白質(zhì)無法從界面上脫附下來，因此後續(xù)的表面固定化方法將設(shè)

13、計(jì)鎖定在可重新產(chǎn)生可重新接附固定結(jié)合分子的表面，同時(shí)降低實(shí)驗(yàn)成本的支出並避免之前吸附實(shí)驗(yàn)殘留所造成的影響。 （a） （b）圖一，（a）直接對(duì)剛吸附Human Albumin的金表面 （b）對(duì)在已停滯一段時(shí)間(4hours30mins) Human Albumin的金表面進(jìn)行表面流過界面活性劑與緩衝液的線上清洗，圖中箭頭所指的位置代表在流動(dòng)系統(tǒng)中灌注不同時(shí)間間期(相同流速下)界面活性劑的起始時(shí)間點(diǎn)。未來工作 接著會(huì)進(jìn)行不同濃度欲進(jìn)行篩選的抗生素與內(nèi)毒素分別流過細(xì)菌內(nèi)毒素的表面固定化與抗生素固定化表面進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，將結(jié)果套入合適的理論模型量化地計(jì)算分析平衡與動(dòng)態(tài)參數(shù)來探討內(nèi)毒素與抗生素間的特異性交互作用，並驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)建立與操作執(zhí)行過程的合適性。此外，分子的固定化修飾表面會(huì)透過利用橢圓儀量測(cè)膜厚、接觸角量測(cè)決定表面親疏水性質(zhì)與表面官能基的偵測(cè)與膜層成分的分析進(jìn)行表面定性，以確定修飾表面處理後組成成分的正確性。參考文獻(xiàn) 1. Angus, D. C., et al. Crit. Care Med. (2001) 29: 1303.2. Opal, S. M., et al.