中醫(yī)不同證型帕金森病患者外周血單個核細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1、中醫(yī)不同證型帕金森病患者外周血單個核細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究                作者：區(qū)健剛 梁清華 陳疆 曾年菊 熊新貴 蕭梅芳 關(guān)勇軍 鄢東紅【摘要】  ：目的 研究中醫(yī)肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證帕金森病患者和正常人外周血單個核細胞(PBMC)的比較蛋白質(zhì)組差異。從蛋白表達水平上探討中醫(yī)肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證的本質(zhì)。方法 用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證帕金森病患者和正常人PBMC總蛋白質(zhì),考馬斯亮藍染色,PD

2、Quest 2-DE軟件分析,對部分差異蛋白質(zhì)點進行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定其膠內(nèi)酶解后的肽質(zhì)指紋圖譜,用Mascot查詢系統(tǒng)查詢SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫。結(jié)果 獲得了分辨率和重復(fù)性均較好的雙向電泳考染圖譜,對其中的15個差異蛋白質(zhì)點分別進行肽質(zhì)指紋分析,經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢,初步鑒定為一些與細胞骨架、抗氧化應(yīng)激、蛋白降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)控等有關(guān)的蛋白質(zhì)。結(jié)論 建立了帕金森病肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證PBMC的雙向凝膠電泳圖譜,提示帕金森病肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證患者和正常人的PBMC的蛋白質(zhì)表達具有差異,這種蛋白質(zhì)組的差異分析有助于為研究肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)

3、證本質(zhì)在蛋白質(zhì)水平上提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  肝陽化風(fēng)血虛生風(fēng)帕金森病單個核細胞雙向凝膠電泳質(zhì)譜Abstract：Objective To investigate the comparative proteomes difference of PBMC between health adults and Parkinson Disease (PD) patients with Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome. So to approach the essence of the two TCM syndro

4、mes from the protein expression level. Methods A series of methods, including immobilolized pH gradient two-dimensional polyacrylamide gel electrophpresis (2-DE), Coomassie Brilliant Blue staining, PDQuest 2-DE analysis software, peptide massfingerprint based on matrix-assisted laser desorption/ioni

5、zation time of flying mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and SWISS-PROT database searching, were used to separate and indentify the proteome of PBMC between health adults and PD patients with Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome. Results The good 2-DE pattern including resolution and

6、reproducibility was obtained. After Coomassie Brilliant Blue staining, 15 spots were incised and analyzed by MALDI-TOF-MS. The typic peptide masses were searched in the SWISS-PROT database by Mascot software. All proteins were preliminarily identified, which ralated to cytoskeleton, anti-oxidative s

7、tress, protein degradation, signal transduction and cell cycle, etc. Conclusions The well-resolved, reproducible 2-DE patterns of Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome PD were established and revealed the protein expression difference of PBMC between the two syndromes of PD patients.

8、 This research is helpful to provide substance evidence in investigation of the essence of Ganyang Huafeng syndrome and Xuexu Shengfeng syndrome on protein level.Key words：Ganyang Huafeng syndrome；Xuexu Shengfeng syndrome；Parkinson Disease；PBMC；two-dimensional polyacrylamide gel electrophpresis (2-D

9、E)；mass spectrometry 帕金森病(Parkinson Disease,PD)是中老年常見的第二大神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,屬于中醫(yī)學(xué)“震掉”、“顫振”,甚至“痙病”和“肝風(fēng)”的范疇,以黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元變性缺失和路易小體(Lewy body)形成為特征。多數(shù)中醫(yī)學(xué)者認為,本病以肝腎不足為本,正虛邪戀,虛實互見,總屬本虛標實,病因繁多,病機復(fù)雜,是一個多病因、多病機參與的難治病。1991年11月,第三屆中華全國中醫(yī)學(xué)會老年腦病學(xué)術(shù)研討會通過了中醫(yī)老年顫證診斷和療效評定標準試行草案(以下簡稱草案),將老年顫證分為痰熱動風(fēng)、血瘀生風(fēng)、氣血兩虛、肝腎不足、陰陽兩虛五個證型,

10、為PD的辨證分型提供了有益的借鑒。臨床報道中有一些醫(yī)生在草案的基礎(chǔ)上又有諸多分型,如血虛生風(fēng)、肝陽化風(fēng)等,并依據(jù)中醫(yī)辨證論治的原則,在實踐中篩選出許多有效治療方法和方藥1。綜觀多年來中醫(yī)藥治療PD的醫(yī)學(xué)實踐,其療效是確切的,但也應(yīng)看到仍存在諸多問題尚待解決。尤其是分型較多,且辨證分型過分強調(diào)證與證之間的區(qū)別,割裂了證與證之間的聯(lián)系。    本實驗利用雙向凝膠電泳技術(shù)對PD肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證患者和正常人外周血單個核細胞(PBMC)進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,獲得了較滿意的雙向電泳(2-DE)圖譜,并用PDQuest分析軟件對2-DE圖譜進行了分析,差異蛋白質(zhì)點經(jīng)基質(zhì)

11、輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定肽質(zhì)指紋圖譜,為進一步研究PD及其辨證提供了實驗基礎(chǔ)。1  對象    PD病例選擇均符合英國帕金森病腦庫臨床診斷標準2,中醫(yī)肝陽化風(fēng)及血虛生風(fēng)辨證標準參照中醫(yī)肝臟象現(xiàn)代研究與臨床中有關(guān)標準3。30例PD患者均來自2006年3月2006年7月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診患者。其中肝陽化風(fēng)證17例,男10例,女7例,年齡3669歲,平均(56.71±10.93)歲；血虛生風(fēng)證13例,男7例,女6例,年齡5065歲,平均(59.23±4.80)歲。正常健康志愿者(對照組)10例,

12、來自同期中南大學(xué)湘雅醫(yī)院健康體檢中心,男女各5例,年齡4965歲,平均(57.30±5.85)歲。各組年齡分布上無差異(P0.699)。均排除心、肝、腎等功能不全者,有活動性胃腸病變者,血液及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者,過敏體質(zhì)者,孕期或哺乳期婦女。入選對象均簽署知情同意書?；颊呒罢＝M每人均抽取10 mL外周靜脈血,PBMC的分離參照經(jīng)典的葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法制備4。2  方法2.1  固相pH梯度雙向凝膠電泳2.1.1  細胞總蛋白質(zhì)的制備 參照湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部腫瘤蛋白質(zhì)組重點實驗室推薦程序制備。每EP管標本(約4050 mg PBMC)放細

13、胞裂解液50 L,反復(fù)振蕩令其充分溶解(10 s/次×8次),每次間隔10 min,離心(7 500 g×1 h,4 ),吸取上清液即為細胞總蛋白質(zhì)。取5 L分裝,1.52 h后按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒的微量測試法測定總蛋白質(zhì)濃度。2.1.2  雙向電泳 主要參照Amersham公司二維凝膠電泳手冊進行。IPGpH3-10NL,24 cm,采用膠內(nèi)泡漲法。將含有1 mg蛋白質(zhì)的各組蛋白提取液分別與IPG膠條水化液混合,進行一向等電聚焦電泳。電泳參數(shù)：30 V 13 h(水化),依次經(jīng)100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、

14、5 000 V 1 h、8 000 V >8 h(8.5 h,68 000 Vh)。等電聚焦結(jié)束后,將IPG膠條分別在含有DTT和碘乙酰胺的平衡液中各平衡15 min。將平衡后IPG的膠條移至12.5%的SDS凝膠上端,進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳條件：每膠2.5 W/T1恒流電泳30 min后,每膠12 W/T2恒流電泳至溴酚藍離膠最底緣約1 mm處停止電泳。將凝膠置考馬斯亮藍染色液(G250磷酸硫酸銨甲醇DDH2O)中12 h后棄去考染液,雙蒸水洗滌2次后,用20%乙醇搖床洗滌脫色至背景清晰后掃描。2.2  凝膠圖像分析 

15、0;  Imagescanner掃描儀掃描考染的凝膠獲取圖像,用PDQuest 2-DE分析軟件進行圖像分析。為消除誤差,將同組的三張2-DE凝膠擬合成為一張平均膠,然后進行組間比較。以正常組2-DE凝膠為參考膠,PD肝陽化風(fēng)組和PD血虛生風(fēng)組與之相互匹配比較,尋找差異蛋白點。2.3  差異蛋白質(zhì)點的肽質(zhì)指紋分析    切下凝膠差異蛋白點,脫色,膠內(nèi)酶切,檢測肽質(zhì)指紋圖(PMF)。Mascot Distiller軟件檢索SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。3  結(jié)果3.1  差異蛋白質(zhì)點的MALDI-TOF-MS肽質(zhì)指紋分

16、析    選取上述15個差異表達蛋白質(zhì)點經(jīng)質(zhì)譜分析得到PMF圖譜后,查詢SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫,全部得到鑒定,共14種非冗余蛋白質(zhì),其功能主要與細胞骨架、抗氧化應(yīng)激、蛋白降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)控等有關(guān),具體蛋白及其在各組的變化趨勢見表1。表1  正常人及PD肝陽化風(fēng)證、血虛生風(fēng)證患者PBMC差異蛋白質(zhì)鑒定（略）注：蛋白點的變化趨勢均以正常組為參照,同一蛋白在不同組的膠圖上進行比較,其中代表較正常組下調(diào)50%；代表下調(diào)75%以上,表示下調(diào)90%以上 3.2  雙向凝膠電泳考染圖譜及差異分析    在

17、相同條件下對來自帕金森病和正常PBMC的總蛋白質(zhì)樣品分別進行了3次雙向電泳(n3)。其總蛋白質(zhì)的分布模式非常相似,以pI 48和Mr 2060 kD范圍的蛋白質(zhì)斑點分布最多。經(jīng)Imagescanner圖像采集和PDQuest 2-DE分析軟件分析,在相同條件下識別的圖像分析探測到正常組PBMC的平均蛋白質(zhì)點數(shù)為(700±30)個,肝陽化風(fēng)證(602±15)個,血虛生風(fēng)證(577±28)個,以正常組膠為參考膠進行膠間斑點匹配,其平均匹配點數(shù)肝陽化風(fēng)證組為(552±16)個,平均匹配率為78.8%,血虛生風(fēng)證組為(494±25)個,平均匹配率為70

18、.6%。不同膠間蛋白質(zhì)點的位置偏差在IEF方向為(2.85±0.48)mm,在SDS-PAGE方向為(2.69±0.37)mm。以上條件能滿足兩細胞間的差異蛋白質(zhì)分析。采用PDQuest軟件建立同組內(nèi)3張2-DE凝膠的平均膠,即計算同組內(nèi)所有凝膠上的同一蛋白質(zhì)點的平均表達量,某個蛋白質(zhì)點的表達量是其在膠上的灰度體積(面積×灰度)。比較3組平均膠的差異(均數(shù)進行成組比較的t檢驗,P<0.05),得到的正常組、肝陽化風(fēng)組、血虛生風(fēng)組PBMC表達差異大于2倍的蛋白質(zhì)點共15個。4  討論    自Abramsky等于1978

19、年提出免疫學(xué)異?？赡苁荘D發(fā)病的重要影響因素之一以來5,近年來越來越多的研究表明,PD中樞神經(jīng)變性及黑質(zhì),紋狀體損傷均與細胞免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)6-10。本實驗發(fā)現(xiàn)PD肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證PBMC的蛋白質(zhì)總數(shù)和一系列蛋白質(zhì)發(fā)生下調(diào),相關(guān)功能發(fā)生減弱。4.1  細胞骨架相關(guān)蛋白    本實驗發(fā)現(xiàn),3個細胞骨架相關(guān)蛋白Talin-1、Rho GDP解離抑制因子2、CAP-1在PD肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證中均有下調(diào),而且血虛生風(fēng)證下降更為明顯。Talin-1作為肌動蛋白結(jié)合蛋白,調(diào)節(jié)微絲的聚合與解聚。Rho GDP解離抑制因子2則為Rho GDI家族成員

20、,通過結(jié)合大量的Rho GTP酶從而調(diào)節(jié)應(yīng)力纖維和粘著斑的形成。而基于CAP-1的肌動蛋白絲循環(huán)是細胞運動性的主要驅(qū)動力11,對于細胞的發(fā)育及形態(tài)學(xué)過程,運動、內(nèi)吞及囊泡運輸發(fā)揮重要作用12。此結(jié)果提示,在PD病理過程中發(fā)生了單個核細胞的激活以及其阿米巴運動和吞噬運動的減弱。而在PD血虛生風(fēng)證中這種減弱較PD肝陽化風(fēng)證更為顯著。4.2  泛素蛋白酶系    泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是體內(nèi)蛋白降解的重要通路。許多研究表明,PD以及其他神經(jīng)變性疾病可能是一類蛋白降解障礙疾病。F-box protein 4是SCF型E3泛素連接酶復(fù)合物底物識別組件,介導(dǎo)蛋白

21、質(zhì)降解,從而影響如細胞周期、信號傳導(dǎo)和基因表達等一系列功能。本實驗發(fā)現(xiàn),PD患者PBMC中F-box protein 4下調(diào),血虛生風(fēng)證較肝陽化風(fēng)證進一步下調(diào)。推測肝陽化風(fēng)證與血虛生風(fēng)證與泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)功能障礙存在聯(lián)系。4.3  抗氧化應(yīng)激酶系    氧化應(yīng)激學(xué)說認為,多巴胺氧化代謝產(chǎn)物造成的胞內(nèi)氧化壓力過盛和細胞抗氧化能力不足是PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)退變的主要原因。硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶(Peroxiredoxin ,Prx)屬于抗氧化蛋白Peroxiredoxin超家族,該蛋白定位于線粒體,調(diào)節(jié)細胞氧化還原,通過分生基團保護敏

22、感酶避免氧化損傷。本實驗發(fā)現(xiàn),Prx在PD肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證PBMC中依次表達下調(diào),揭示肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證與Prx下降導(dǎo)致的氧化應(yīng)激功能減弱有關(guān)。4.4  信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白    不均一核糖核酸蛋白K(hnRNP-K)是一種核酸結(jié)合蛋白,能夠結(jié)合細胞核及線粒體的前信使RNA及單鏈DNA,作為一個轉(zhuǎn)錄因子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及細胞周期調(diào)節(jié)發(fā)揮作用,并影響線粒體的基因表達及功能。Transgelin-2屬于鈣結(jié)合蛋白家族,以前僅在平滑肌細胞中研究較多,在淋巴細胞中很少報道。最近,Rubén Francés等發(fā)現(xiàn),在腹膜B1細胞和被

23、刺激的脾臟B2細胞中表達,并推測其作用機制為通過限制肌動蛋白的解聚作用從而調(diào)整BCR信號傳導(dǎo)來激活該類細胞13。我們研究發(fā)現(xiàn),hnRNP-K和Transgelin-2在PD肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證PBMC中表達下調(diào),血虛生風(fēng)證中下降更為明顯,提示在肝陽化風(fēng)和血虛生風(fēng)證中發(fā)生了細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙。4.5  Ras相關(guān)蛋白    另外,本實驗發(fā)現(xiàn),Rap1b蛋白和Ras抑制蛋白1(Rsu-1)兩種Ras相關(guān)蛋白在PD肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證中表達相繼下降,Rap1b蛋白定位于細胞膜、脂錨、細胞質(zhì)側(cè),是RAP1的主要異構(gòu)體14。很多研究表明,Rap信號能夠調(diào)整多種細

24、胞過程包括細胞分化和粘附。而Ras抑制蛋白1(Rsu-1)在真核生物中的各種細胞和組織中廣泛存在,作用于Ras 信號傳導(dǎo)途徑。Masuelli L等15研究提示,Rsu-1能夠通過Ras途徑激活神經(jīng)生長因子,加速細胞分化。兩種Ras相關(guān)蛋白在PD肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證PBMC中表達相繼下調(diào),表明兩證的發(fā)生與Ras相關(guān)的細胞分化障礙有關(guān)。4.6  多功能蛋白酶    磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1(PEBP-1)是一種高度保守的絲氨酸蛋白酶抑制劑,在各種組織特別是神經(jīng)組織中廣泛存在。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),hPEBP家族中的hPEBP4通過抑制MAPK途徑的活化16及磷脂酰乙

25、醇胺的分泌從而對抗TNF-誘導(dǎo)的細胞凋亡17。PEBP的N端片斷能夠轉(zhuǎn)化為海馬膽堿能神經(jīng)刺激肽HCNP,可能涉及到中樞海馬區(qū)的發(fā)育成熟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸前膽堿能神經(jīng)元的功能18。Cyclophilin A是一種普遍存在且含量豐富的胞溶質(zhì)蛋白,系免疫抑制劑環(huán)胞霉素A的作用靶,具有肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶(PPIase)活性,保證蛋白質(zhì)的正確的空間折疊。一直以來,人們對于PPIase的研究主要集中在其介導(dǎo)的免疫抑制作用。但Gold19發(fā)現(xiàn),同樣具有PPIase活性的FKBP12在神經(jīng)系統(tǒng)中的含量比在免疫系統(tǒng)中要高出50倍以上,其介導(dǎo)的FK506在體內(nèi)外均可以促進神經(jīng)再生。另有學(xué)者認為,Cycl

26、ophilin A是一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)分泌的生長因子20。本實驗發(fā)現(xiàn),PD患者PBMC中PEBP-1和Cyclophilin A這兩種抗凋亡和促進細胞生長的蛋白表達下降與帕金森病的神經(jīng)退行性變是否存在聯(lián)系值得進一步的探討,對肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證的本質(zhì)有提示作用。    綜上所述,PD肝陽化風(fēng)證和血虛生風(fēng)證PBMC中蛋白質(zhì)數(shù)目下降和相關(guān)蛋白表達的改變導(dǎo)致PBMC的阿米巴運動和吞噬運動、抗氧化應(yīng)激、蛋白降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長分化、抗凋亡等功能均發(fā)生了不同程度的減弱,且PD血虛生風(fēng)證下降較肝陽化風(fēng)證更為顯著。中醫(yī)理論認為,肝陽化風(fēng)和血虛生風(fēng)同屬肝風(fēng)內(nèi)動,其根本病機為肝腎陰

27、虛,陰不制陽則陽亢化風(fēng),久病也可由肝血虧虛而誘發(fā)肝風(fēng)內(nèi)動,兩者之別在于肝陽化風(fēng)證為虛中夾實,血虛生風(fēng)證則為虛中之虛。結(jié)合本實驗,我們認為,肝腎陰虛肝風(fēng)內(nèi)動則PBMC相關(guān)功能發(fā)生減弱,肝陽化風(fēng)證虛中挾實,PBMC功能減弱并不顯著,機體尚能調(diào)節(jié)自身正氣；久病機體正氣愈傷,生血虛生風(fēng)證為虛中之虛,PBMC功能進一步減退。研究結(jié)果在蛋白質(zhì)水平上支持兩證上述中醫(yī)理論,為兩者病機的聯(lián)系及區(qū)別提供了物質(zhì)基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I】  1 黃俊山.震顫麻痹辨證體會J.實用中西醫(yī)結(jié)合雜志,1996,9(1)：8.2 Hughes AJ, Daniel SE, Kilford L, et al. Accuracy

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