富血小板血漿制備套裝的評(píng)估研究_李明

1、Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, January 2011, Vol. 25, No.1112富血小板血漿制備套裝的評(píng)估研究李明 1張長(zhǎng)青 1袁霆 1陳圣寶 1呂汝舉 2【 摘 要】 目的 通過分析富血小板血漿 (platelet-rich plasma, PRP 中血小板、 白細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的濃度, 計(jì)算 回收率和富集系數(shù), 并做相關(guān)性分析, 探討 PRP 制備套裝的實(shí)用性和穩(wěn)定性。 方法 取 30例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的自愿者自 愿捐贈(zèng)的外周血各 40 mL, 應(yīng)用山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司的 PRP 制

2、備套裝制備 PRP 各 4 mL。全自動(dòng) 血液分析儀計(jì)數(shù)全血和 PRP 中血小板和白細(xì)胞濃度, 并計(jì)算血小板或白細(xì)胞回收率及富集系數(shù) ; 并分別測(cè)定男、 女自愿者 血小板及白細(xì)胞濃度。 ELISA 法定量分析激活后全血及 PRP 中 PDGF 、 TGF-、 VEGF 的濃度。 結(jié)果 全血和 PRP 中 血小板濃度分別為 (131.40 29.44 109/L和 (819.47 136.32 109/L, 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t = 27.020, P =0.000 ; PRP 中血小板回收率為 60.85% 8.97%, 富集系數(shù)為 6.40 1.06。全血和 PRP 中白細(xì)胞濃度分別為

3、 (5.57 1.91 1012/L和 (32.20 10.42 1012/L, 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t = 13.780, P =0.000 ; PRP 中白細(xì)胞回收率為 58.30% 19.24%, 富集 系數(shù)為 6.10 1.93。 PRP 中血小板濃度和白細(xì)胞濃度分別與全血中血小板濃度 (r =0.652, P =0.000 和白細(xì)胞濃度 (r =0.460, P =0.011 成正相關(guān)。男性組和女性組 PRP 中血小板濃度和白細(xì)胞濃度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P 0.05 。 PRP 中 PDGF 、 TGF-、 VEGF 濃度分別為 (698.15 64.48 、 (681.3

4、6 65.90 、 (1 071.55 106.04 ng/mL, 是全血的 (5.67 1.18 、 (6.99 0.61 、 (5.74 0.83倍。 PRP 中 PDGF 濃 度 (r =0.832, P =0.020 、 TGF-濃 度 (r =0.835, P =0.019 、 VEGF 濃 度 (r =0.824, P =0.023 均與 PRP 中血小板濃度成正相關(guān)。 結(jié)論 PRP制備套裝可以穩(wěn)定地制備出富含高濃度血小板、 白 細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的 PRP ?！?關(guān)鍵詞】 富血小板血漿 血小板 白細(xì)胞 制備套裝 富集系數(shù) 回收率ASSESSMENT STUDY ON A SET OF

5、 PLATELET-RICH PLASMA PREPARATION/LI Ming1, ZHANG Changqing1, YUAN Ting1, CHEN Shengbao1, L Ruju2. 1Department of Orthopedics, the Sixth Peoples Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai, 200233, P.R.China; 2Shandong Weigao Group Medical Polymer Company Limited. Corresponding author: ZHANG Ch

6、angqing, E-mail: zhangchangq2010【 Abstract 】 ObjectiveTo calculate the recovery rate and enrichment factor and to analyse the correlation by measuring the concentrations of platelets, leukocyte, and growth factors in platelet-rich plasma (PRP so as to evaluate the feasibility and stability of a set

7、of PRP preparation. Methods The peripheral blood (40 mL was collected from 30 volunteers accorded with the inclusion criteria, and then 4 mL PRP was prepared using the package produced by Shandong Weigao Group Medical Polymer Company Limited. Automatic hematology analyzer was used to count the conce

8、ntrations of platelets and leukocyte in whole blood and PRP. The enrichment factor and recovery rate of platelets or leukocyte were calculated; the platelet and leukocyte concentrations of male and female volunteers were measured, respectively. The concentrations of platelet-derived growth factor (P

9、DGF, transforming growth factor (TGF-, and vascular endothelial growth factor (VEGF were assayed by ELISA. Results The platelet concentrations of whole blood and PRP were (131.40 29.44 109/L and (819.47 136.32 109/L, respectively, showing signi cant difference (t= 27.020, P=0.000. The recovery rate

10、of platelets was 60.85% 8.97%, and the enrichment factor was 6.40 1.06. The leukocyte concentrations of whole blood and PRP were (5.57 1.91 1012/L and (32.20 10.42 1012/L, respectively, showing signi cant difference (t= 13.780, P=0.000. The recovery rate of leukocyte was 58.30% 19.24%, and the enric

11、hment factor was 6.10 1.93. The concentrations of platelets and leukocyte in PRP were positively correlated with the platelet concentration (r=0.652, P=0.000 and leukocyte concentration (r=0.460, P=0.011 in whole blood. The concentrations of platelet and leukocyte in PRP between male and female were

12、 not signi cantly different (P 0.05. The concentrations of PDGF, TGF-, and VEGF in PRP were (698.15 64.48, (681.36 65.90, and (1 071.55 106.04 ng/m L, which were (5.67 1.18, (6.99 0.61, and (5.74 0.83 times higher than those in the whole blood, respectively. PDGF concentration (r=0.832, P=0.020, TGF

13、- concentration (r=0.835, P=0.019, and VEGF concentration (r=0.824, P=0.023 in PRP were positively correlated with platelet concentration of PRP. Conclusion PRP with high concentrations of platelets, white blood cells and growth factors can be prepared stably by this package.基金項(xiàng)目 :國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (3047

14、1747 ; 國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目 (30801221作者單位 :1上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科 (上海, 200233 ; 2山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司通訊作者 :張長(zhǎng)青, 教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向 :股骨頭壞死、 骨修復(fù)、 組織工程, E-mail: zhangchangq2010網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間 :2010-12-10 15:18:14; 網(wǎng)絡(luò)出版地址 :中國(guó)修復(fù)重建外科雜志 2011年 1月第 25卷第 1期 113【 Key words】 Platelet-rich plasma Platelet Leukocyte Preparation kit Enri

15、chment factor Recovery rateFoundation items:National Natural Science Foundation of China (30471747; National Natural Science Foundation of China for Youths (30801221自上世紀(jì) 90年代富血小板血漿 (platelet-rich plas-ma , PRP 技術(shù)問世以來, 學(xué)者們對(duì)其制備技術(shù)和設(shè)備 進(jìn)行了大量研究, 并取得了顯著成果。目前, 美國(guó) FDA 認(rèn)證并商業(yè)化生產(chǎn)的 PRP 制備系統(tǒng)有 9種, 其中部分 制備系統(tǒng)能快速穩(wěn)定地獲

16、得 PRP , 但獲得的 PRP 在血 小板回收率及濃度方面存在較大差異, 如 Sequire 系統(tǒng) 血小板回收率僅為 31% 15%, AutoloGel 和 Sequire 系統(tǒng)制備的 PRP 血小板濃度分別是生理濃度的 1倍和 1.6倍, 均未達(dá)到 PRP 發(fā)揮作用的 “治療濃度” 1-2。此 外, 這些 PRP 制備系統(tǒng)價(jià)格較昂貴, 不利于 PRP 技術(shù) 在臨床的廣泛應(yīng)用。在國(guó)內(nèi), 雖然目前 PRP 已應(yīng)用于 骨科、 整形外科、 口腔外科等多個(gè)領(lǐng)域 3-5, 但尚無專業(yè) 的 PRP 制備系統(tǒng), 多采用開放式二次離心法制備, 存在 PRP 易受外界污染、 血小板回收率相對(duì)較低、 易受操作

17、 因素影響、 制備方法不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司根據(jù) PRP 在臨床應(yīng)用的特點(diǎn)設(shè)計(jì)開發(fā)了一套 PRP 制備套 裝, 該套裝已通過了國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的認(rèn)證。 本實(shí)驗(yàn)通過分析采用此套裝獲得的 PRP 中血小板、 白 細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的濃度, 計(jì)算相關(guān)回收率和富集系數(shù), 并進(jìn)行相關(guān)性分析, 以檢驗(yàn)此套裝的實(shí)用性和穩(wěn)定性, 從而為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取 30例成年健康自愿者捐獻(xiàn)的外周血, 男女各 15例 ; 年齡 2476歲, 平均 47歲。自愿者納入標(biāo)準(zhǔn) :符合 中華人民共和國(guó)獻(xiàn)血法 和衛(wèi)生部頒布的 獻(xiàn) 血體格檢查標(biāo)準(zhǔn) , 血紅蛋白 11

18、g/L, 血小板 1.5 109/L。采血前 5 d內(nèi)未服用影響血小板功能和凝血 系統(tǒng)的藥物。無傳染性疾病、 相關(guān)血液疾病、 嚴(yán)重心 血管疾病及感染。1.2主要試劑與儀器枸櫞酸鈉注射液 (天津金耀氨基酸有限公司 ; 凝 血酶凍干粉 (常州千紅生化制藥股份有限公司 ; 氯 化鈣注射液 (上海信誼金朱藥業(yè)有限公司 ; PDGF 、 TGF-、 VEGF ELISA試 劑 盒 (R&D Systems公 司, 美 國(guó) 。 PRP 制備套裝 (山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股 份有限公司 ; TDL-5臺(tái)式多管架懸擺離心機(jī) (上海安 亭科學(xué)儀器廠 ; KX-21全自動(dòng)血液分析儀 (SYSMEX 公司, 日

19、本 ; 酶標(biāo)儀 (Thermo Scienti c公司, 美國(guó) 。 1.3 PRP 制備方法用預(yù)先裝有 5 mL枸櫞酸鈉注射液的 50 mL一 次性注射器以 18 G針頭于每例志愿者肘前靜脈取血 40 mL。搖勻后, 取 1 mL作血細(xì)胞分析, 4 mL作生長(zhǎng) 因子濃度測(cè)定 ; 剩余 40 mL注入 PRP 制備套裝離心管 中, 于嚴(yán)格無菌狀態(tài)下制備 PRP 。根據(jù)血液中各組分 的沉降系數(shù)不同, 以離心半徑 15 cm、 2 000 r/min 離心 10 min后, 全血分為 3層, 上層為上清液, 下層為紅細(xì) 胞, 兩層交界處一淺黃色層即 PRP 層。打開離心管最 左側(cè)通氣孔, 20 mL

20、注射器連接離心管中間吸管孔, 吸 取下層紅細(xì)胞約 16 mL。將剩余血液同上法離心后, 可見在底部紅細(xì)胞表面有白膜樣物質(zhì), 即為血小板和 白細(xì)胞沉積層 ; 其上部為透明的血漿層。再次打開通 氣孔, 20 mL注射器連接無菌吸引管, 經(jīng)離心管右側(cè)吸 引孔吸取上部大部分血漿, 保留離心管中約 4 mL血 漿。靜置片刻后振蕩離心管約 5 min, 使血小板充分重 懸于剩余血漿中, 即得到 PRP 。1.4檢測(cè)指標(biāo)1.4.1血細(xì)胞分析 分別將 1 mL抗凝靜脈血和制備 的 PRP 采用全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)分析, 測(cè)定 血小板及白細(xì)胞濃度, 并計(jì)算 PRP 中血小板和白細(xì)胞 濃度變異系數(shù)。計(jì)算 P

21、RP 中血小板或白細(xì)胞回收率和 富集系數(shù), 回收率 =PRP中血小板或白細(xì)胞總數(shù) /全血 中血小板或白細(xì)胞總數(shù) 100%, 富集系數(shù) =PRP中血 小板或白細(xì)胞濃度 /全血中血小板或白細(xì)胞濃度。分 別測(cè)定男、 女自愿者 PRP 血小板及白細(xì)胞濃度。1.4.2生長(zhǎng)因子濃度測(cè)定 于 4 mL抗凝靜脈血中加 入 0.4 mL凝血酶和氯化鈣混合物 (2 000 U凝血酶中 加入 5 mL 5%氯化鈣溶液 , 3 min后血液凝聚成凍膠 狀, 常溫下靜置 1 h后, 同上法離心 10 min, 吸取上清 液轉(zhuǎn)移到凍存管中。將制備的 PRP 采用相同方法制備 得到富含生長(zhǎng)因子的上清液。取制備的全血及 PR

22、P 上 清液, 按照 ELISA 試劑盒說明測(cè)定 PDGF 、 TGF-及 VEGF 濃度。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均 數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示, 對(duì)全血和 PRP 中血小板和白細(xì)胞濃 度、 PRP 中血小板和白細(xì)胞的回收率和富集系數(shù)、 PRP 中生長(zhǎng)因子濃度采用 Pearson 檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析 ; 全血Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, January 2011, Vol. 25, No.1114和 PRP 中血小板及白細(xì)胞濃度比較、 男女組間血小板 和白細(xì)胞濃度比較采用 t 檢驗(yàn)

23、 ; 檢驗(yàn)水準(zhǔn) =0.05。2結(jié)果2.1血細(xì)胞分析全 血 和 PRP 中 血 小 板 濃 度 分 別 為 (131.40 29.44 109/L和 (819.47 136.32 109/L,比 較 差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t = 27.020, P =0.000 ; PRP 中血小 板回收率為 60.85% 8.97%, 富集系數(shù)為 6.40 1.06。 全 血 和 PRP 中 白 細(xì) 胞 濃 度 分 別 為 (5.57 1.91 1012/L和 (32.20 10.42 1012/L, 比 較 差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué)意義 (t = 13.780, P =0.000 ; PRP 中白細(xì)胞回收率

24、為 58.30% 19.24%, 富集系數(shù)為 6.10 1.93。 PRP 中 血小板濃度和白細(xì)胞濃度分別與全血中血小板濃度 (r =0.652, P =0.000 和白細(xì)胞濃度 (r =0.460, P =0.011 成正相關(guān)。 PRP 中血小板 (r =0.743, P =0.000 和白細(xì) 胞 (r =0.945, P =0.000 的回收率和富集系數(shù)間成正相 關(guān)。另外, 分析 PRP 回收率和富集系數(shù)數(shù)據(jù)顯示均為 正態(tài)分布 (P 值分別為 0.671和 0.706 , 且標(biāo)準(zhǔn)差分別 為 1.06和 8.97。 PRP 中血小板和白細(xì)胞的濃度變異系 數(shù)分別為 16.64%和 32.36%

25、。男 性 組 和 女 性 組 PRP 中 血 小 板 濃 度 分 別 為 (792.07 161.05 109/L和 (846.87 104.63 109/L , 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t = 1.110, P =0.279 ; 兩 組 PRP 中 白 細(xì) 胞 濃 度 分 別 為 (29.91 10.13 1012/L 和 (34.5 10.53 1012/L, 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義 (t = 1.220, P =0.234 。2.2生長(zhǎng)因子濃度測(cè)定全血中 PDGF 、 TGF-、 VEGF 濃度分別為 (126.10 7.89 、 (100.14 10.53 、 (185.58 16.8

26、3 n g/mL; PRP 中 分 別 為 (698.15 64.48 、 (681.36 65.90 、 (1 071.55 106.04 ng/mL, 是 全 血 的 (5.67 1.18 、 (6.99 0.61 、 (5.74 0.83倍。 PRP 中 PDGF 濃 度 (r =0.832, P =0.020 、 TGF-濃 度 (r =0.835, P =0.019 、 VEGF 濃度 (r =0.824, P =0.023 均與 PRP 中血小板濃 度成正相關(guān)。3討論3.1影響因素分析3.1.1 血小板計(jì)數(shù) PRP的血小板計(jì)數(shù)在一定程度上 影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)論的客觀性和可比性, 但血小板

27、計(jì)數(shù)受 很多因素的影響, 包括體內(nèi)和體外兩方面。在體內(nèi), 除 受多種藥物影響外, 血小板本身還存在生理性波動(dòng), 不 同年齡、 不同季節(jié)、 一天中不同時(shí)間的血小板濃度呈規(guī) 律性變化 6; 此外, 從不同部位、 不同體位或運(yùn)動(dòng)前后 取血進(jìn)行檢測(cè), 血小板計(jì)數(shù)也呈顯著性差異 7。在體 外, 血小板易受外源性刺激而被破壞或者激活, 如動(dòng)作 粗暴、 抽血時(shí)間過長(zhǎng)、 針頭過小、 止血帶運(yùn)用不當(dāng)、 不適 當(dāng)?shù)目鼓齽┖蛢?chǔ)血器、 搖勻程度、 放置時(shí)間等均會(huì)人為 造成血小板活化和破壞, 影響計(jì)數(shù)。 Woodell-May 等 8發(fā)現(xiàn), PRP 血小板計(jì)數(shù)與震蕩時(shí)間有關(guān), 他們建議 PRP 在振蕩器上振蕩應(yīng)不少于

28、5 min才可能得到較準(zhǔn)確的 血小板計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)為保證樣本的同質(zhì)性, 所有抽血、 離心和血 細(xì)胞計(jì)數(shù)分析均由同一組醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行, 全程操作輕 柔 ; 盡量讓自愿者在相同狀態(tài)下快速順利一次性取血 ; 計(jì)數(shù)前充分震蕩混勻 PRP ; 所有樣本均在采血后 1 h內(nèi)檢測(cè)完。但我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中仍存在影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的可能因素, 比如第 1次離心后吸取底層紅細(xì)胞的量 是通過注射器刻度和個(gè)人經(jīng)驗(yàn)來判斷, 存在一定誤差, 直接影響了第 2次離心后剩余 PRP 的量, 因?yàn)樵黾映?取的血液量和減少第 1次離心后底層紅細(xì)胞量, 均會(huì) 增加 PRP 中血小板和白細(xì)胞濃度。此外, 考慮到部分 自愿者年齡偏大, 靜脈穿刺

29、較難, 有 10名自愿者在止 血帶幫助下抽取靜脈血, 這也可能造成 PRP 批內(nèi)差異 較 大 。3.1.2穩(wěn)定性分析 目前已上市的 PRP 制備系統(tǒng)設(shè)計(jì) 原理基本相同, 但不同研究結(jié)果仍存在較大差異, 這可 能與實(shí)際操作時(shí)的不穩(wěn)定因素有關(guān), 比如離心力和離 心時(shí)間的選擇, 離心管的管徑、 長(zhǎng)度, 操作者的熟練程 度等。不同離心方法對(duì)應(yīng)了不同的離心力和離心時(shí)間, 其制備的 PRP 中血小板濃度和活性也各不相同。目 前 制 備 PRP 的 方 法 包 括 Anitua 法、 Petrungaro 法、 Landesberg 法及 Aghaloo 法等 9-12, 大多學(xué)者首選二次 離心法 13。一

30、般認(rèn)為, PRP 中的血小板在體外較脆弱 且容易被激活, 過高的離心速度會(huì)使血小板膜破裂, 降 低其生物活性, 因此離心時(shí)速度不宜過快。 Sonnleitner 等 14發(fā)現(xiàn)第 1次離心時(shí)采用 160 g 離心 20 min后, 交界面以下 6 mm的血小板濃度最高 ; 第 2次離心以 400 g 離心 15 min后, 試管底部血小板濃度超過 2 107/uL, 約達(dá)正常血小板濃度的 10倍。 Marx 15則認(rèn)為 離心力 (g 與離心時(shí)間 (min 的乘積超過 11 000 g . min 時(shí), 血小板將被大量破壞, 造成生長(zhǎng)因子流失。經(jīng)比 較 研 究 證 實(shí), Landesberg 法

31、(兩 次 離 心 均 為 200 g 、 離 心 10 min 制 備 的 PRP 中 血 小 板 濃 度 高, 活 化 率 小 3, 16-17。但也有學(xué)者認(rèn)為采用第 1次以 200 g 離心 10 min, 第 2次以 1 200 g 離心 10 min的方法制備的 PRP 中血小板濃度和回收率高 18。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí) 發(fā)現(xiàn)當(dāng)抽血量低于 20 mL, 離心力約為 200 g 時(shí), 用中國(guó)修復(fù)重建外科雜志 2011年 1月第 25卷第 1期 115此套裝可以制備出 PRP , 但按照本實(shí)驗(yàn)之前的設(shè)計(jì), 取 血量為 40 mL時(shí), 則不能成功制備出 PRP 。分析原因 可能有兩方面 :第一,

32、取血量少時(shí), 對(duì)離心力要求低, 但 考慮到臨床對(duì) PRP 中血小板濃度的要求, 必須有較大 的離心血量, 而較多的血量對(duì)離心力要求較高。第二, 若離心試管直徑小, 則血液成分容易分層, 所需離心力 小。而該套裝為了滿足對(duì)血量的需求, 離心管直徑大, 所以需要更大的離心力。因此, 實(shí)驗(yàn)中我們以離心半 徑 15 cm、 2 000 r/min 離心 10 min的條件離心 2次后 成功制備 PRP 。本實(shí)驗(yàn) PRP 富集系數(shù)和回收率均為正態(tài)分布 (P 值分別為 0.671和 0.706 , 且標(biāo)準(zhǔn)差分別為 1.06和 8.97, 表明采用此套裝可以較穩(wěn)定地獲得高濃度血小板。另 外通過計(jì)算濃度變異系

33、數(shù)來比較批內(nèi)各次制備 PRP 中 血小板和白細(xì)胞的濃度差異大小, 也可在一定程度上 反映出此套裝制備 PRP 的穩(wěn)定性。 PRP 中血小板和白 細(xì)胞的濃度變異系數(shù)分別為 16.64%和 32.36%, 可以 認(rèn)為 PRP 中制備得到的血小板較白細(xì)胞更穩(wěn)定。 3.1.3性別因素對(duì) PRP 制備的影響 本實(shí)驗(yàn)中, PRP 中血小板和白細(xì)胞濃度男女組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義, 提示用此套裝制備的 PRP 不受性別因素影響。但 本組 30例自愿者中有 2例 (分別為男 73歲, 女 65歲 在第 1次離心后出現(xiàn)溶血現(xiàn)象, 我們認(rèn)為可能與自愿 者年齡偏大, 紅細(xì)胞脆性增加有關(guān)。3.1.4生長(zhǎng)因子濃度與血小

34、板的關(guān)系 由于 PRP 主要 通過高濃度血小板釋放出的生長(zhǎng)因子來發(fā)揮其修復(fù)作 用, 因此理論上講, 生長(zhǎng)因子的濃度應(yīng)該與血小板濃度 成正相關(guān), 但對(duì)此尚未達(dá)成共識(shí)。我們的實(shí)驗(yàn)測(cè)定的 PRP 中生長(zhǎng)因子濃度與 PRP 中血小板濃度成正相關(guān), 這與多項(xiàng)研究結(jié)論相同 6-7, 19。3.2 PRP分類由于制備方法和步驟有很大差異, 目前將 PRP 大 致分為兩種 :貧白細(xì)胞 PRP (即只含有高濃度的血 小板 和富白細(xì)胞 PRP (含有高濃度的 PRP 和白細(xì) 胞 10, 20。 研 究 認(rèn) 為, 富 白 細(xì) 胞 PRP 相 比 貧 白 細(xì) 胞 PRP 能更持久地釋放生長(zhǎng)因子和纖維膠原等成分 21-

35、22, 因此更適合應(yīng)用于損傷組織修復(fù)和再生。隨著對(duì)制備技術(shù)的不斷研究, 越來越多的設(shè)備能 夠制備出非凝膠狀態(tài)的富白細(xì)胞 PRP 以滿足臨床應(yīng) 用。非凝膠狀態(tài)的 PRP 因?yàn)榭扇藶樵O(shè)定凝血酶或氯 化鈣的添加時(shí)間, 適合于注射或者局部創(chuàng)面等運(yùn)動(dòng)醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域 ; 而凝膠狀態(tài) PRP 則很難進(jìn)行注射等操作, 但 由于其良好的組織構(gòu)架和強(qiáng)度, 可用于口腔頜面外科。 正是基于貧白細(xì)胞和富白細(xì)胞 PRP 各自的特點(diǎn)和本實(shí) 驗(yàn)的設(shè)計(jì)目的, 我們?cè)谌屑尤肟鼓齽┑耐瑫r(shí), 在第 2次離心后提取白細(xì)胞和血小板。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 應(yīng) 用此套裝能成功提取出高濃度和高回收率的富白細(xì)胞 PRP , 白細(xì)胞回收率為 58.30

36、% 19.24%, 白細(xì)胞富集系 數(shù)為 6.10 1.93。3.3 與其他制備系統(tǒng)的比較目前, 美國(guó) FDA 認(rèn)證并商業(yè)化生產(chǎn)的 9種 PRP 制備系統(tǒng)均對(duì)應(yīng)著不同的制備技術(shù), 但制備 PRP 的 基 本 方 法 均 為 離 心 法。 9種 系 統(tǒng) 平 均 制 備 時(shí) 間 為 17.67 min, 平均血小板富集系數(shù)為 4.24, 平均血小板回 收率為 60.2%, 制備套裝的平均價(jià)格為 533.89美元。 其中 AutoloGel 系統(tǒng)用時(shí)最少, 但其最終產(chǎn)物是 PRP 凝膠而非液態(tài)的 PRP 。而本實(shí)驗(yàn)采用的套裝制備 PRP 所需時(shí)間約 20 min, 血小板回收率和富集系數(shù)分別達(dá) 到 6

37、0.85% 8.97%和 6.40 1.06, 與其他 PRP 制備系 統(tǒng)比較均屬于較好水平 (表 1 。表 1各種 PRP 制備系統(tǒng)相關(guān)參數(shù)比較Tab.1 Comparison of related parameters of various preparation system of PRP設(shè)備名稱Equipment制備時(shí)間(min Time (min 血小板富集系數(shù)Enrichmentfactor血小板回收率 (%Recovery rate(%套裝價(jià)格 (美元 Cost ($ Cell Saver BasedSystem20467575175 Sorin Angel254.376495

38、GenesisCS 1610 368.00 1.751 550 AutoloGel 12178325 Harvest SmartPrep216472 10395 Depuy Symphony16472 1095 Arterlocyte MedicalMagelian175.170350495 Sequire 201.631 15395本 實(shí)驗(yàn) PRP 制備套裝 206.40 1.0660.85 8.97未知 3.4本實(shí)驗(yàn) PRP 制備套裝特點(diǎn)由于臨床及研究用 PRP 在使用前常通過加入激活 劑激活血小板, 之后與支架材料混合或直接植入缺損 修復(fù), 故制備 PRP 的全過程需嚴(yán)格無菌。本實(shí)驗(yàn)采用

39、 的套裝內(nèi)包括了制備及應(yīng)用 PRP 所需要的所有用品 ; 離心管設(shè)計(jì)為 3個(gè)孔, 分別為通氣孔 (內(nèi)有納米級(jí)過濾 膜過濾空氣 、 中間吸管孔 (抽取 PRP 和下層紅細(xì)胞 、 右側(cè)離心管孔 (抽取上層 PPP , 保證了前述所有接觸 血液的操作均在離心管內(nèi), 避免轉(zhuǎn)移操作中的二次污 染和血小板激活 ; 套裝中的 PRP 噴槍包組合后可將凝 血酶與 PRP 同時(shí)噴灑注射至創(chuàng)面, 從而防止形成凝膠 后不易注射使用的缺點(diǎn), 同時(shí)使 PRP 分布更均勻, 增加 了其臨床實(shí)用性。而且此套裝通過特殊設(shè)計(jì)的離心管Chinese Journal of Reparative and Reconstructive

40、 Surgery, January 2011, Vol. 25, No.1116阻位裝置和與之配套的吸取管, 減少了操作者因素對(duì) 制備過程的影響, 可重復(fù)性強(qiáng)。但因該 PRP 制備套裝中與離心管配套的吸引管長(zhǎng) 度是固定的, 在不傾斜離心管的情況下, 恰好與離心管 底緣滑坡處齊平 (約 3.5 mL位置 , 因此在血量較少時(shí) 為了獲得較高濃度的 PRP 就會(huì)傾斜離心管以吸棄更多 上清, 這往往會(huì)造成較大的誤差。綜上述, 本實(shí)驗(yàn)采用的 PRP 制備套裝可制備高濃 度血小板的 PRP , 同時(shí)對(duì)白細(xì)胞也有較好的收集作用。4 參考文獻(xiàn)1 Eppley BL, Woodell JE, Higgin J.

41、 Platelet quanti cation and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound heal-ing. Plast Reconstr Surg, 2004, 114(6: 1502-1508.2 Weibrich G, Hansen T, Kleis W, et al. Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration. Bone, 2004, 3

42、4(4: 665-671.3 郭彥杰 , 仇建軍 , 張長(zhǎng)青 . 富血小板血漿治療下肢慢性難愈合傷口 47例隨訪研究 . 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志 , 2008, 22(11: 1301-1305. 4 張劍明 , 劉春年 , 高平 , 等 . 富血小板血漿在口腔種植中的臨床應(yīng)用 . 天津醫(yī)藥 , 2009, 37(11: 970-971.5 林敏魁 , 陳小玲 , 趙欣 , 等 . 不同濃度凝血酶對(duì)富血小板血漿修復(fù)顱 骨缺損的影響 . 中國(guó)組織程研究與臨床康復(fù) , 2010, 14(2: 209-213. 6 劉靜靜 , 劉巧玲 . 血小板計(jì)數(shù)參考值調(diào)查及生理性波動(dòng)的觀察 . 中 原醫(yī)刊 , 2

43、002, 29(9: 59-60.7 袁霆 , 張長(zhǎng)青 . 富血小板血漿促進(jìn)骨修復(fù)的研究進(jìn)展 . 國(guó)外醫(yī)學(xué) : 骨 科學(xué)分冊(cè) , 2004, 25(1: 46-49.8 Woodell-May JE, Ridderman DN, Swift MJ, et al. Producing accurate platelet counts for platelet rich plasma: validation of a hematology analyzer and preparation techniques for counting. J Craniofac Surg, 2005, 16(5:

44、749-756.9 Anitua E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int J Oral Maxillofac Im-plants, 1999, 14(4: 529-535.10 Petrungaro PS. Using platelet-rich plasma to accelerate soft tissue mat-uration in esthetic periodontal surgery. Comp

45、end Contin Educ Dent, 2001, 22(9: 729-732, 734.11 Landesberg R, Roy M, Glickman RS. Quanti cation of growth factorlevels using a simpli ed method of platelet-rich plasma gel prepara-tion. J Oral Maxillofac Surg, 2000, 58(3: 297-301.12 Aghaloo TL, Moy PK, Freymiller EG. Investigation of platelet-rich

46、 plasma in rabbit cranial defects: A pilot study. J Oral Maxillofac Surg, 2002, 60(10: 1176-1181.13 Bennett NT, Schultz GS. Growth factors and wound healing: biochem-ical properties of growth factors and their receptors. Am J Surg, 1993, 165(6: 728-737.14 Sonnleitner D, Huemer P, Sullivan DY. A simplified technique for producing platelet-r