第一章血液樣本采集和血涂片制備

1、第1章 血液樣本采集和血涂片制備1、 血液生理概要1、 血液組成：由血細(xì)胞(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板)和血漿組成 血漿：血液加抗凝劑后分離出來的淡黃色液體 血清：離體后的血液自然凝固析出的淡黃色透明液體 兩者區(qū)別:血清缺少某些凝血因子，如凝血因子(纖維蛋白原)、(凝血酶原)、等；血漿除鈣離子外，含有其他全部凝血因子。 全血適用于臨床血液學(xué)檢查，如血細(xì)胞計數(shù)、分類和形態(tài)學(xué)檢查等。 血漿適用于血漿生理性和病理性化學(xué)成分的測定，特別是內(nèi)分泌激素測定，也適用于血栓與止血的檢查。 血清適用于臨床化學(xué)和臨床免疫學(xué)檢查。2、 血液理化性質(zhì)： 血量：正常成人4-5L，約為7010mlkg體重，占體重的6%-8%

2、，其中血漿占55%，血細(xì)胞占45%。 顏色：動脈血氧和血紅蛋白含量較高，呈鮮紅色； 靜脈血還原血紅蛋白含量較高，呈暗紅色。 嚴(yán)重貧血者顏色變淺，嚴(yán)重一氧化碳或氰化物中毒者，呈櫻桃紅色。 pH：正常人7.35-7.45。動脈血為7.40，靜脈血為7.35 血液比密：男性為1.055-1.063，女性為1.051-1.060。血漿為1.025-1.030，血細(xì)胞為1.090。血液比密與紅細(xì)胞含量、血紅蛋白含量有關(guān)，血漿比密和血漿內(nèi)蛋白濃度有關(guān)。 血漿滲透壓：290-310mOsm(kgH2O)。3、 血液特性：紅細(xì)胞的懸浮穩(wěn)定性、黏滯性、凝固性4、 生理功能：運(yùn)輸功能、協(xié)調(diào)功能、維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定

3、和防 御功能2、 采血方法1、 靜脈采血法2、 皮膚采血法(曾稱毛細(xì)血管采血法)3、 真空采血法(又稱負(fù)壓采血法)：采血裝置分：套筒式、頭皮靜脈式3、 抗凝劑選擇抗凝：用物理或化學(xué)的方法除去或抑制血液中的某些凝血因子，以阻止血液凝固。抗凝劑或抗凝物質(zhì)：能夠阻止血液凝固的物質(zhì)。常用抗凝劑和使用方法如下：1、 乙二胺四乙酸(EDTA)鹽：常用有鈉鹽)(EDTA-Na2H2O)或鉀鹽(EDTA-K2H2O)，能與血液中鈣離子結(jié)合成鰲合物，使Ca2+失去凝血作用，阻止血液凝固。EDTA鹽對血細(xì)胞形態(tài)、血小板計數(shù)影響很小，適用于血液學(xué)檢查，尤其是血小板計數(shù)。但鈉鹽溶解度低于鉀鹽，有時影響抗凝效果。國際血

4、液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(ICSH)建議CBC(全血細(xì)胞計數(shù))抗凝劑用EDTA-K22H2O，量為1.5-2.2Mg/ml血液。不適于凝血檢查、血小板功能試驗(yàn)。2、 草酸鹽：常用有草酸鈣、草酸鉀、草酸銨，溶解后解離的草酸根離子能與血液中鈣離子形成草酸鈣沉淀，是Ca2+失去凝血作用，阻止血液凝固。優(yōu)點(diǎn)是溶解度好、價廉。對凝血因子的保護(hù)作用差，影響凝血酶原時間測定，而且草酸鹽與鈣結(jié)合后形成的沉淀物，影響自動凝血儀檢測結(jié)果，因此，不適于凝血檢查。雙草酸鹽抗凝劑：草酸鉀可使紅細(xì)胞體積縮小，草酸銨則可使紅細(xì)胞脹大，二者按適當(dāng)比例混合，恰好不影響紅細(xì)胞形態(tài)和體積，可用于血細(xì)胞比容(Hct)、CBC、網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)(

5、Ret)等項(xiàng)目檢查?？墒寡“寰奂?、影響白細(xì)胞形態(tài)，不適于血小板計數(shù)、白細(xì)胞分類計數(shù)。3、 肝素：加強(qiáng)抗凝血酶(AT-)滅活絲氨酸蛋白酶作用，阻止凝血酶的形成，并阻止血小板聚集等作用，從而阻止血液凝固，是生理性抗凝劑。廣泛存在于肺、肝、脾等幾乎所有組織和血管周圍肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞顆粒中，帶有較多負(fù)電荷。常用肝素鈉鹽或鉀鹽，每毫升血液肝素用量為152.5U。優(yōu)點(diǎn)是抗凝力強(qiáng)、不影響血細(xì)胞體積、不易溶血等。絕大多數(shù)檢查都可用肝素作為抗凝劑，是紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)的理想抗凝劑。但可引起白細(xì)胞聚集，瑞氏染色后產(chǎn)生藍(lán)色背景，不適于CBC、細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查。4、 枸櫞酸鹽：常用有枸櫞酸鈉，能與血液中鈣離子結(jié)

6、合形成螯合物，阻止血液凝固。但溶解度低，抗凝力不如上述抗凝劑。適用于紅細(xì)胞沉降率、凝血檢查，也是輸血保養(yǎng)液的成分。與血液的抗凝比例為1：9(凝血功能的檢查)或1：4(血沉)。4、 血液涂片制備1、 載玻片的清潔：新載玻片常帶有游離堿質(zhì)，必須用1mol/HCL浸泡24h，清水沖洗，干燥后備用。用過的載玻片可用適量肥皂或其他洗滌劑煮沸20min，趁熱刷去血膜，清水沖洗，必要時蒸餾水浸泡，干燥后備用。要保持載玻片的清潔、干燥、中性、無油膩。2、 血涂片的制備：有手工推片法、載玻片壓拉法、棕黃層圖片法等。血涂片可用非抗凝靜脈血或毛細(xì)血管血，也可用EDTA抗凝血液制備。EDTA抗凝血有時能引起紅細(xì)胞皺縮

7、和白細(xì)胞聚集，因此最好使用非抗凝血制備血涂片。 一張良好的血涂片，應(yīng)厚薄適宜、頭體尾分明、細(xì)胞分布均勻、血膜邊緣整齊，并留有一定空隙。5、 血液細(xì)胞染色 血涂片在用光學(xué)顯微鏡觀察前需要固定和染色。 固定：將細(xì)胞蛋白質(zhì)和多糖等成分迅速交聯(lián)凝固，以保持細(xì)胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。 染色：是使細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等染上不同的顏色，以便于鏡下觀察識別。染色方法大多源自羅氏染色法，常用瑞氏染色法、姬姆薩染色法。1、 瑞氏染色法：瑞氏染料 由酸性染料伊紅(E-)和堿性染料亞甲藍(lán)(M+)組成。伊紅通常為鈉鹽，有色部分為陰離子。亞甲藍(lán)(又名美藍(lán))為四甲基硫堇染料，通常為氯鹽，即氯化美藍(lán)，有

8、色部分為陽離子。美藍(lán)容易氧化為一、二、三甲基硫堇等次級染料(即天青)。將適量伊紅、美藍(lán)溶解在甲醇中，即為瑞氏染料。甲醇作用：一是溶解美藍(lán)和伊紅；二是固定細(xì)胞形態(tài)。染色原理 既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用。pH值的影響 細(xì)胞各種成分均屬蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液pH而定，在偏酸性環(huán)境中正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，紅細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞染色偏紅，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色或不染色；在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，易與美藍(lán)結(jié)合，所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色，顆粒呈深暗，嗜酸性顆粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性顆粒偏粗，呈紫黑色。稀釋染液必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致細(xì)胞染色反應(yīng)呈色異常，形態(tài)難以識別

9、，甚至錯誤。染色方法采血推片干燥標(biāo)記染色：滴加液3-5滴，使其迅速蓋滿血涂片，約0.5-1min后，滴加等量或稍多的液，輕輕搖動或用吸而球吹氣，使染液充分混合沖洗：5-10min后用流水沖去染液，待干后鏡檢注意事項(xiàng)血涂片面積太小會影響結(jié)果觀察，故應(yīng)在距載玻片另一端2cm處結(jié)束推片為宜應(yīng)于血涂片干透后固定，否則細(xì)胞在染色過程中容易脫落加染液應(yīng)適量，過少易蒸發(fā)形成沉淀，使細(xì)胞不易檢查沖洗時應(yīng)以流水沖洗，不能先倒掉染液，以防染料沉著在血涂片上。沖洗時間不能過久，以防脫色。如血涂片上有染料顆粒沉積，可滴加甲醇，然后立即用流水沖洗染色過淡可以復(fù)染，復(fù)染時應(yīng)先加緩沖液，后加染液。染色過深可用流水沖洗或浸泡

10、，也可用甲醇脫色。2、 姬姆薩染色：染色原理 姬姆薩染液由天青、伊紅組成。原理和結(jié)果和瑞氏染色基本相同染色方法同瑞氏染色-步驟固定：將干燥后的血涂片用甲醇固定3-5min染色：將血涂片置于用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.4-6.8)稀釋10-20倍的姬姆薩染液中，浸泡10-30min沖洗6、 方法學(xué)評價1、 血涂片制備：手工推片法用血量少、操作簡單，是應(yīng)用最廣泛的方法。棕黃層涂片法可提高異常情況的陽性檢出率。此外，瘧原蟲、微絲蚴等檢查可采用厚血涂片法。2、 血液細(xì)胞染色：瑞氏染色法是最經(jīng)典、最常用的染色法，尤其對于細(xì)胞質(zhì)成分、中性顆粒等可獲得很好的染色效果，但對細(xì)胞核的著色略差。姬姆薩染法對細(xì)胞核、寄生蟲(如瘧原蟲等)著色較好，結(jié)構(gòu)更清晰，但對細(xì)胞質(zhì)成分的著色能力較差。7、 質(zhì)量控制1、 血涂片制備：血滴愈大、角度愈大、推片速度愈快，血膜愈厚，反之則愈