分子生物學(xué)講座5

1、分子生物學(xué)講座5原核生物啟動子原核生物啟動子2、真核生物啟動子的基本結(jié)構(gòu)、真核生物啟動子的基本結(jié)構(gòu) 真核生物的啟動子有其特殊性，真核生物有多種真核生物的啟動子有其特殊性，真核生物有多種RNA聚合酶，每一種都有自己的啟動子類型。以聚合酶，每一種都有自己的啟動子類型。以RNA聚合酶聚合酶的啟動子結(jié)構(gòu)為例，人們比較了上百個真核生物的啟動子結(jié)構(gòu)為例，人們比較了上百個真核生物RNA聚合酶聚合酶的啟動子核苷酸序列的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在的啟動子核苷酸序列的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在-25區(qū)有區(qū)有TATA框，又稱為框，又稱為Hogness框或框或Goldberg-Hogness框。其框。其一致序列為一致序列為T28A97A93A8

2、5A63T37A83A50T37，基本上都由，基本上都由A，T堿基所組成，又叫堿基所組成，又叫 TATA框?？?。Hogness boxTATA box -75區(qū)-25區(qū)+1，起始點上游CAAT box TATA TATA框決定了轉(zhuǎn)錄的起始部位，即框決定了轉(zhuǎn)錄的起始部位，即RNARNA聚合酶要和它結(jié)合才可以開始轉(zhuǎn)錄。聚合酶要和它結(jié)合才可以開始轉(zhuǎn)錄。CAATCAAT框則決定了轉(zhuǎn)錄的起始頻率?？騽t決定了轉(zhuǎn)錄的起始頻率。 由于真核生物突變體的誘導(dǎo)和鑒定非由于真核生物突變體的誘導(dǎo)和鑒定非常困難，所以，真核生物啟動子的研究遠(yuǎn)常困難，所以，真核生物啟動子的研究遠(yuǎn)比原核生物困難。比原核生物困難。 除啟動子外，

3、真核生物轉(zhuǎn)錄起始點上除啟動子外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始點上游處還有一個稱為增強子的序列，它能極游處還有一個稱為增強子的序列，它能極大地增強啟動子的活性，它的位置往往不大地增強啟動子的活性，它的位置往往不固定，可存在于啟動子上游或下游。固定，可存在于啟動子上游或下游。 在在原核生物原核生物中，當(dāng)中，當(dāng)RNA聚合酶的聚合酶的 亞基發(fā)現(xiàn)其亞基發(fā)現(xiàn)其識別位點（識別位點（ -35區(qū)）時，全酶就與啟動子的區(qū)）時，全酶就與啟動子的-35區(qū)區(qū)序列結(jié)合形成一個封閉（指序列結(jié)合形成一個封閉（指DNA為雙鏈狀態(tài)）為雙鏈狀態(tài)）的啟動子復(fù)合物。由于全酶分子較大（大約可以的啟動子復(fù)合物。由于全酶分子較大（大約可以覆蓋覆蓋70b

4、p的長度），其另一端可到達(dá)的長度），其另一端可到達(dá)-10區(qū)。這區(qū)。這時，整個酶分子向時，整個酶分子向-10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合，序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合，在此處發(fā)生局部在此處發(fā)生局部DNA的解鏈（一般在的解鏈（一般在12-17bp左左右），形成全酶和啟動子的開放性（右），形成全酶和啟動子的開放性（DNA為單為單鏈狀態(tài)）復(fù)合物。鏈狀態(tài)）復(fù)合物。三、轉(zhuǎn)錄的開始和延伸三、轉(zhuǎn)錄的開始和延伸 在復(fù)合物中起始位點和延長位點被相應(yīng)在復(fù)合物中起始位點和延長位點被相應(yīng)的核苷酸充滿，在的核苷酸充滿，在RNA聚合酶聚合酶亞基催化下亞基催化下形成形成RNA的第一個磷酸二酯鍵。的第一個磷酸二酯鍵。RNA合成合成的第一個

5、核苷酸總有的第一個核苷酸總有GTP或或ATP，以，以GTP常見。常見。 此時此時 因子就完成了它這一次起始的使命，因子就完成了它這一次起始的使命，從全酶解離下來，靠核心酶在從全酶解離下來，靠核心酶在DNA鏈上向鏈上向下游滑動，而脫落的下游滑動，而脫落的 因子與另一個核心酶因子與另一個核心酶結(jié)合成全酶，可以反復(fù)利用。結(jié)合成全酶，可以反復(fù)利用。 真核生物真核生物的轉(zhuǎn)錄起始機制非常復(fù)雜，還的轉(zhuǎn)錄起始機制非常復(fù)雜，還不是很清楚。因為有多種轉(zhuǎn)錄酶，每一種不是很清楚。因為有多種轉(zhuǎn)錄酶，每一種都有它的特異性。但是，可以知道的是，都有它的特異性。但是，可以知道的是，有許多蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子要參與起始和延伸。有許多

6、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子要參與起始和延伸。（參考（參考p408-410） 轉(zhuǎn)錄的速度：轉(zhuǎn)錄的速度：30-50bp/秒，但不是恒定秒，但不是恒定的，會有變化。的，會有變化。四、轉(zhuǎn)錄四、轉(zhuǎn)錄的終止的終止（Termination) 轉(zhuǎn)錄是在DNA模板某一位置上停止的，人們比較了若干原核生物RNA轉(zhuǎn)錄終止位點附近的DNA序列，發(fā)現(xiàn)DNA模板上的轉(zhuǎn)錄終止信號有兩種情況: 一類是不依賴于蛋白質(zhì)因子而實現(xiàn)的終止作用， 一類是依賴蛋白質(zhì)輔因子才能實現(xiàn)終止作用，這種蛋白質(zhì)輔因子稱為釋放因子，通常又稱因子。 兩類終止信號有共同的序列特征，在轉(zhuǎn)錄終止之前有一段回文結(jié)構(gòu)。v不依賴不依賴因子的終止序列中富含因子的終止序列中富含G

7、C堿基對，其下堿基對，其下游游6-8個個A。v依賴依賴因子的終止序列中因子的終止序列中GC堿基對含量較少，其堿基對含量較少，其下游序列也沒有固定的特征，轉(zhuǎn)錄生成的下游序列也沒有固定的特征，轉(zhuǎn)錄生成的RNA可形可形成二級結(jié)構(gòu)即柄一嚕噗結(jié)構(gòu)，又稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這樣成二級結(jié)構(gòu)即柄一嚕噗結(jié)構(gòu)，又稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這樣的二級結(jié)構(gòu)可能與的二級結(jié)構(gòu)可能與RNA聚合酶某種特定的空間結(jié)構(gòu)聚合酶某種特定的空間結(jié)構(gòu)相嵌合，阻礙了相嵌合，阻礙了RNA聚合酶進(jìn)一步發(fā)揮作用聚合酶進(jìn)一步發(fā)揮作用 。v除除DNA模板本身的終止信號外，在模板本身的終止信號外，在 噬菌體中，噬菌體中，發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)有協(xié)助發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)有協(xié)助RNA聚合酶跨

8、越終止部位的聚合酶跨越終止部位的作用，叫抗轉(zhuǎn)錄終止蛋白。作用，叫抗轉(zhuǎn)錄終止蛋白。終止序列的特征：終止序列的特征：真核生物由于RNA轉(zhuǎn)錄后很快就進(jìn)行了加工，因此很難確定原初轉(zhuǎn)錄物的3末端。病毒SV40的終止位點經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，很像大腸桿菌的不依賴因子的終止子，轉(zhuǎn)錄后的RNA可形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3末端帶有一連串的U。爪蟾5sRNA的3末端有4個U，它們前后的序列為富含GC的序列，這是所有真核生物RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的終止信號。這種序列特征高度保守，從酵母到人都很相似，任何改變這種序列特征的突變都將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止位置的改變。 第二節(jié)第二節(jié) RNARNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾 提示：提示：原核或

9、真核生物的原核或真核生物的rRNAs和和tRNAs都是以都是以初級轉(zhuǎn)錄本初級轉(zhuǎn)錄本(transcript)形式被合成的，然形式被合成的，然后加工成為成熟的后加工成為成熟的RNA分子。分子。絕大多數(shù)原核生物的絕大多數(shù)原核生物的mRNA卻不需加工，卻不需加工，仍為初級轉(zhuǎn)錄本的形式。仍為初級轉(zhuǎn)錄本的形式。真核生物產(chǎn)生的真核生物產(chǎn)生的mRNA要經(jīng)過復(fù)雜的加工要經(jīng)過復(fù)雜的加工才能成為成熟的才能成為成熟的RNA。加工過程大致分為。加工過程大致分為四種。四種。一、一、mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄后加工的轉(zhuǎn)錄后加工1、原核生物、原核生物 轉(zhuǎn)錄生成的一條mRNA可以包含幾個基因，有共同的啟動子和共同終止信號，編碼幾種

10、不同的蛋白質(zhì)。例如乳糖操縱子上的Z、Y及A基因，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可翻譯生成三種酶，即半乳糖苷酶，透過酶和乙?；D(zhuǎn)移酶。原核生物中沒有核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的，往往轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已經(jīng)開始了，因此原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA沒有特殊的轉(zhuǎn)錄后加工修飾過程。 2、真核生物、真核生物 真核生物轉(zhuǎn)錄一個mRNA分子，只編碼一種蛋白質(zhì)分子。真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對5端和3端的修飾以及對中間部分進(jìn)行剪接。（1）加帽：轉(zhuǎn)錄開始后，mRNA就會通過鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶在5端催化產(chǎn)生5-5之間的磷酸二酯鍵。再通過鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶在G7位甲基化，這種帽子叫“0型帽子”。用符號表示：m7GpppX

11、。在酵母當(dāng)中，這種類型的帽子占據(jù)絕對優(yōu)勢。 如果在第一個核苷酸的如果在第一個核苷酸的2-O位上再發(fā)生甲基位上再發(fā)生甲基化，則形成了化，則形成了“2型帽子型帽子”，符號表示為：，符號表示為：m7GpppXm 。這種形式是除了單細(xì)胞真核生。這種形式是除了單細(xì)胞真核生物以外的其他大多數(shù)真核生物帽子的主要形物以外的其他大多數(shù)真核生物帽子的主要形式。式。 在某些真核生物中，還存在著第二個核苷在某些真核生物中，還存在著第二個核苷酸（可以是四種中的任何一個）的酸（可以是四種中的任何一個）的2-O位上位上再發(fā)生甲基化的情況，這樣就產(chǎn)生了再發(fā)生甲基化的情況，這樣就產(chǎn)生了“3型帽型帽子子”。用符號表示為：。用符號

12、表示為：m7GpppXmpYm，這，這種類型比較少，只有戴帽子種類型比較少，只有戴帽子mRNA的的10-15%左右。左右。 不同生物的帽子結(jié)構(gòu)不同，進(jìn)化程度高，不同生物的帽子結(jié)構(gòu)不同，進(jìn)化程度高，結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。三種不同的三種不同的55端端“帽子帽子”三種不同的三種不同的55端端“帽子帽子”（2）5帽子的作用：主要包括： 它是mRNA 做為翻譯起始的必要的結(jié)構(gòu)，對核糖體對mRNA的識別提供了信號。“0型帽子”是核糖體識別mRNA的必需結(jié)構(gòu)。體外翻譯試驗表明，沒有帽子的mRNA，不能進(jìn)行有效的翻譯。 這種帽子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA 免遭5外切核酸酶的攻擊。 幫助其從

13、核內(nèi)運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)里。 大多數(shù)的RNA病毒都可以在他們的基因組和mRNA上加帽，有些自己不能加帽的可以從宿主細(xì)胞的mRNA中偷帽子，叫“搶帽”（cap-snatching）。（3）多聚腺苷酸尾巴）多聚腺苷酸尾巴大多數(shù)（2/3）的真核mRNA 都有3端的多聚（A)尾巴，多聚（A)尾巴大約為200bp。多聚（A)尾巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。此反應(yīng)受poly（A）聚合酶（又叫RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶）催化，并加上約200個A殘基。 過程：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3末端由一個特異酶切除一端，該酶可以識別這個酶切位點上游13-20bp附近的特殊序列AAUAAA，此序列高度保守，又叫“加尾信號”。如果

14、U發(fā)出突變，則切除和加尾效率明顯降低。（4） polyA尾巴功能：尾巴功能： 關(guān)于polyA尾巴的功能問題盡管經(jīng)過極其廣泛的探索，但還不完全清楚。有人推測polyA可能與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)送到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，但是相當(dāng)數(shù)量的沒有polyA尾巴的mRNA如組蛋白mRNA，也照樣通過核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。還有人認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)對真核mRNA的翻譯效率具有某種作用，并能穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)，保持一定的生物半衰期。有人也認(rèn)為和小核RNA（snRNA）有關(guān)。snRNA不是單獨起作用 。二二、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工的轉(zhuǎn)錄后加工原核生物原核生物原核生物大腸桿菌有三種原核生物大腸桿菌有三種rRNA，即，即5S，16S和和23S，分

15、別有，分別有120bp，1541bp和和2904bp。其中其中5S的核苷酸中有一段保守序列，可以和的核苷酸中有一段保守序列，可以和tRNA的的T C環(huán)結(jié)合，是二者相互識別的位環(huán)結(jié)合，是二者相互識別的位點。點。 原核生物原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工，包括以下幾轉(zhuǎn)錄后加工，包括以下幾方面：方面：大腸桿菌中有大腸桿菌中有7種操縱子，這些操縱子中排列種操縱子，這些操縱子中排列著著rRNA和和tRNA基因，其中基因，其中rRNA 首先合成一首先合成一個個30S的前體；的前體；前體被大腸桿菌的前體被大腸桿菌的RNase，RNaseE等剪切等剪切成一定鏈長的成一定鏈長的rRNA分子；分子；rRNA分子在修飾酶催化下進(jìn)行堿基修飾；分子在修飾酶催化下進(jìn)行堿基修飾；rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體的大、小亞基與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體的大、小亞基 。真核生物真核生物真核生物真核生物rRNA前體比原核生物大，包括四種前體比原核生物大，包括四種rRNA，S，18S，28S和和5S。其中前面。其中前面3個來自一個共同的個