制劑學技術(shù)提高植酸酶熱穩(wěn)定性的研究進展

1、 植酸酶稱為肌醇六磷酸酶,屬于磷酸單酯水解酶,是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(磷酸鹽的酶類總稱。植酸酶是一種重要的工業(yè)酶,是近年來出現(xiàn)的一種新型綠色添加劑,添加到動物飼料中,主要用于豬和家禽,并在一定程度上應(yīng)用于魚。植酸酶作為單胃動物飼料添加劑使用時,可以使植物性飼料磷的利用率提高60%,減少飼料中無機磷的添加量,降低飼料成本;能夠使動物糞便中無機磷的排出量減少40%,降低磷對環(huán)境的污染,保護環(huán)境并可改善可用性礦物質(zhì)、微量元素、氨基酸和能源;還可以解除植酸對金屬離子和蛋白質(zhì)的螯合作用,提高機體對蛋白質(zhì)和多種微量元素的利用率,促進動物生長發(fā)育,提高生產(chǎn)性能。植酸酶的抗逆性,尤其是熱穩(wěn)定性不能

2、滿足飼料及飼料加工的要求,成為制約植酸酶推廣應(yīng)用的重要限制性因素之一。鑒于植酸酶對提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益和降低磷對環(huán)境的污染有重要意義,提高植酸酶的耐熱性成為科研領(lǐng)域研究的新熱點。1影響植酸酶產(chǎn)品熱穩(wěn)定性的因素1.1植酸酶菌株從煙曲霉和黑曲霉中分離的植酸酶添加到飼料中,在制粒溫度為75時,這2種植酸酶在顆粒飼料中的活性回收率是相似的;但在制粒溫度為85時,來自黑曲霉的植酸酶活性比來自煙曲霉的植酸酶活性要喪失得更多。1.2制粒過程制粒過程中的高溫、高濕和擠壓是造成植酸酶活性損失的關(guān)鍵因素:1高溫引起酶蛋白分子中氫鍵和疏水鍵斷裂,從而改變酶分子的構(gòu)象,使酶失活。生物酶制劑熱穩(wěn)定性差,易失活,在常溫條件

3、下長期存放的干燥酶粉也易失活。顆粒溫度達到84或87時,則酶的活性喪失17%或54%;2R P Igamnazarov等(1999指出,植酸酶去折疊溫度與水分活度相關(guān)。完全干燥的植酸酶去折疊溫度為165;含12%的水分時去折疊溫度迅速降為95;含16%的水分時去折疊溫度降為8890。在制粒時,濕與熱同時起作用。相比干熱,濕熱更具穿透性,更能夠穿透到植酸酶內(nèi)部,破壞酶的三維結(jié)構(gòu);3高壓能改變酶蛋白的空間多維結(jié)構(gòu)而導致酶變性。制劑學技術(shù)提高植酸酶熱穩(wěn)定性的研究進展張萍1,2王成潤1鄒積宏2金一11.浙江大學藥學院2.黑龍江大學生命科學學院摘要植酸酶作為一種生物型飼料添加劑對提高飼料中磷的利用率、動

4、物的生產(chǎn)性能及減輕動物高磷排泄物對環(huán)境的污染具有重要意義,因此,植酸酶的研究有重要的科學和實用價值。但由于其熱穩(wěn)定性差,推廣和應(yīng)用受到了限制。關(guān)鍵詞植酸酶熱穩(wěn)定性制劑學中圖分類號:S816.7文獻標志碼:A文章編號:1002-2813(201001-0019-04收稿日期:2009-09-25通信作者:金一 1.3動物消化道pH酶的活性具有確定的最適pH,pH的變化可引起酶中基團的解離,導致酶結(jié)構(gòu)變化,從而影響酶的活性。動物消化道內(nèi)有一條適合生化反應(yīng)進行的pH譜線。Lindberg(2007報道,豬日糧中添加植酸酶后,在胃中可檢測到總酶活超過50%,極顯著高于小腸前段和后段。1.4植酸酶產(chǎn)品的

5、劑型植酸酶產(chǎn)品包括,液體酶、粉酶、普通顆粒酶和包被型顆粒酶。液體酶的熱穩(wěn)定性差,但它是在制粒后噴涂在顆粒表面,因此避免制粒中濕熱破壞。粉酶完全暴露在濕熱環(huán)境中,熱穩(wěn)定性較差。普通顆粒酶隔離分子與外界接觸,一定程度上提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。包被顆粒酶是將成型后的顆粒植酸酶采用包衣劑,在表面形成一層堅固而易溶的薄膜,使植酸酶顆粒與外界隔離,同時避免飼料中礦物元素等對酶活的破壞,耐高溫水平也有一定提高,熱穩(wěn)定性最強,使用范圍更廣。Eeckhout等(2000研究發(fā)現(xiàn),在82條件下,豬飼料中顆粒植酸酶的活性保留值為60%。而NOVO和BASF公司生產(chǎn)的包被顆粒植酸酶在85下處理30s,酶活性保留率約達到

6、70%;而對照組是未經(jīng)包被的酶粉,其酶活保留率僅為20%。2制劑學技術(shù)提高植酸酶熱穩(wěn)定的方法提高植酸酶熱穩(wěn)定性常用的方法有以下幾種: 1自然選擇法:即篩選耐高溫菌種釋放的植酸酶;2固定化包埋:將酶固定在不溶性載體上,從而穩(wěn)定酶構(gòu)象,消除逆性因子的變形作用,從而提高植酸酶穩(wěn)定性;3蛋白質(zhì)工程法:即通過基因工程重組得到耐高溫酶的基因,再表達獲得熱穩(wěn)定性植酸酶;4化學修飾法:通過化學試劑特異性修飾酶活性中心的某個或某類氨基酸,從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象,提高其耐熱性;5制劑學方法:通過向植酸酶溶液添加穩(wěn)定劑、將植酸酶與載體結(jié)合制成普通顆粒、將植酸酶顆粒進行液體后噴涂和包被等制劑學技術(shù)來提高植酸酶的熱穩(wěn)定性

7、。2.1添加穩(wěn)定劑1鹽。鹽的添加能顯著改善酶的熱穩(wěn)定性,因為鹽類主要存在離子鍵作用,當酶的活性中心含有離子作為配位體時,降低分子內(nèi)靜電排斥作用,增加酶的穩(wěn)定性。另外,鹽可作為水分子的替代物占據(jù)水的位置,排除自由水對酶造成的不穩(wěn)定影響。鹽的種類和質(zhì)量濃度也會影響到植酸酶的熱穩(wěn)定性。據(jù)報道,陽離子的穩(wěn)定化作用是(CH34N+>NH4+>K+、Na+>Mg2+>Ca2+>Ba2+,陰離子是SO42->Cl->Br->NO3-,因此,一般采用的無機鹽有MgSO4、(NH42SO4、CaSO4、CaCl2、MgCl2和NaCl等。Ha等(2000研究一種新

8、的熱穩(wěn)定性的植酸酶部分或充分結(jié)合Ca2+時的晶體結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ca2+對于該酶的活力和熱穩(wěn)定性有重要作用。Yang Mun Choi等(2001從Bacillus sp KHU-10中制取的植酸酶液中加入一定量的Ca2+,在60下保溫10min后其相對酶活為98%,而未加Ca2+的原酶液在同樣溫度下保溫相同時間后相對酶活幾乎為零。蘇東海等(2004研究不同種類及不同質(zhì)量濃度的鹽在干熱和濕熱條件下對植酸酶活性的影響,在干熱情況下,相對包被質(zhì)量濃度為5%的Na2SO4或10%的NaCl抗干熱效果較好;在濕熱情況下,15% NaCl或5%Na2SO4的保護作用達到最大值,MgSO4和(NH42SO

9、4作用不明顯。專利EP0758018A1描述在用鹽來穩(wěn)定固態(tài)植酸酶時,發(fā)現(xiàn)二價陽離子效果最好而且無機鹽與酶的質(zhì)量比控制在5%90%效果較好。2多羥基化合物。多羥基醇和糖類等多羥基化合物能形成氫鍵,通過氫鍵與酶蛋白表面分子相連接,使酶蛋白分子穩(wěn)定化;有助于形成可增加表面張力和溶液黏度的溶劑層,降低蛋白水解而起到穩(wěn)定酶的作用。多羥基化合物還能夠通過填補酶空間結(jié)構(gòu)的空隙,降低由于加熱引起酶空間結(jié)構(gòu)改變而導致的酶活損失。專利WO93/16175描述用尿素、甘油或山梨醇等來穩(wěn)定液態(tài)植酸酶。陳惠等(2004研究發(fā)現(xiàn),分別加入甘露醇、葡萄糖和海藻糖均能提高植酸酶在高溫下的熱穩(wěn)定性,與不加糖的對照組比,酶活力

10、平均保留率約提高10%,其中以0.4mol/L海藻糖提高植酸酶熱穩(wěn)定的效果最好。蘇東海等(2004研究不同種類及不同質(zhì)量濃度的糖在干熱和濕熱條件下對植酸酶活性的影響,在干熱情況下,添加40mg/g海藻糖的抗干熱效果最好,蔗糖其次,葡萄糖較差;在濕熱情況下,3種糖在60mg/g酶質(zhì)量濃度內(nèi)對保留剩余酶活都有一定的作用。3其他穩(wěn)定劑。Chang Chih Chen等(2001研究發(fā)現(xiàn),在植酸酶溶液中加入可溶性淀粉和高粱糖漿廢棄液可提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。在80下加熱 10min,仍有67%的酶活。其原因可能是:高粱糖漿廢棄液和淀粉阻止傳熱,對酶起到一定的保護作用,但其保護機制還需進一步研究。專利WO

11、2005/074707以酪蛋白為穩(wěn)定劑,與含有ZnSO4的植酸酶濃縮發(fā)酵液及玉米淀粉混合制軟材,應(yīng)用擠出滾圓的方法制得植酸酶顆粒。與對照組相比,78制粒條件下酶活保留率提高10%。2.2制備普通顆粒制備普通植酸酶顆粒時首先要篩選合適的載體。合適的載體要具有如下特征:1載體形成的顆粒要有一定的機械硬度;2載體不能使酶活性降低;3載體在水中能迅速崩解釋放出植酸酶;4載體不能與飼料中的成分發(fā)生反應(yīng),以保證植酸酶的活性和穩(wěn)定性。動物飼料添加劑中常用載體有玉米淀粉、玉米芯粉、云石粉和乳糖等。普通顆粒酶相當于將植酸酶分子封閉在若干個小區(qū)內(nèi),隔離分子與外界的接觸,一定程度上提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。2.3液體后

12、噴涂技術(shù)近年來,有些飼料顆粒制造廠采取外噴的方法添加植酸酶。制粒冷卻后在其飼料顆粒表面上噴涂液態(tài)植酸酶,但這需要額外增加某些加工設(shè)備及加工工序,而且外噴方法不易添加均勻,并且在運輸過程很容易將顆粒外表噴涂的植酸酶磨擦掉,失去添加意義。這使得液體后噴涂技術(shù)在生產(chǎn)穩(wěn)定性植酸酶中的應(yīng)用受到限制。2.4制備包被型顆粒采用包被技術(shù)將植酸酶內(nèi)添加,能有效的降低植酸酶在制粒等高溫高濕處理過程中活性的損失,又能均勻的混合在動物顆粒飼料中,易于動物采食,大大提高植酸酶的利用效率。包被工藝與制藥領(lǐng)域中制備包衣顆粒劑的工藝基本一致。包衣材料的篩選和包被工藝的選擇,不僅影響著包被植酸酶的抗逆性,即耐高溫和高濕,還要求

13、包被顆粒在動物消化道內(nèi)迅速釋放被胃腸道利用,且在包衣后外表面形成較為堅固的膜,能夠起到阻熱、防潮和隔絕空氣的作用。從實際生產(chǎn)方面考慮,還要求包衣材料價格較低廉,加工成本低。1國外制備包被型顆粒研究狀況。國外研究植酸酶熱穩(wěn)定性的時間較早,包被型植酸酶顆粒技術(shù)較為成熟。西歐和北美的有些科研機構(gòu)在提高飼用酶制劑的熱穩(wěn)定性方面取得較大的進展。歐洲著名的酶制劑生產(chǎn)商NOVO和BASF公司自20世紀90年代開始對飼用酶在飼料高溫制粒條件下的熱穩(wěn)定性進行研究,取得重大進展。他們采用的包被型飼用植酸酶生產(chǎn)工藝為,在植酸酶濃縮液中加入纖維素、碳酸鈣和糊精,經(jīng)混合、擠壓、切割、圓整、低溫干燥和篩分,制成含酶小顆粒

14、。然后再涂抹由氫化牛油、碳酸鈣和高嶺土組成的混合物,低溫干燥,制成包被型含酶顆粒。該包被型顆粒酶經(jīng)制粒溫度85處理30s,酶活性保留率約達到70%;而對照組未經(jīng)包被的酶粉酶活保留率僅為20%,植酸酶的熱穩(wěn)定性得到了大幅度的提高。專利WO2007/044968篩選了33個處方,其中在8595制粒溫度下處理30s后酶活保留率超過90%的處方,是以硫酸鈉晶體為核心,應(yīng)用流化床頂噴制粒法向核心噴涂植酸酶發(fā)酵液、玉米淀粉和聚乙烯醇(PVA,制成含酶顆粒。再在噴霧干燥包衣機中向含酶顆粒連續(xù)地噴涂保護層PVA和滑石粉,然后經(jīng)過干燥慢慢冷卻的過程制成包被型含酶顆粒。2國內(nèi)制備包被型顆粒研究狀況。由于植酸酶在畜

15、牧行業(yè)和環(huán)境保護中的重要意義,近年來我國學者和科研機構(gòu)也做了大量工作,并取得一定成效。蘇東海等(2004觀察不同種類及不同質(zhì)量濃度的糖和鹽在干熱及濕熱的情況下對植酸酶殘存酶活的影響,通過正交試驗得到包埋顆粒,當蔗糖的添加量為40mg/g時,氯化鈉包覆用量為淀粉質(zhì)量的10%,明膠作外包被,用量為淀粉質(zhì)量的1.5%,得到包埋顆粒,其包埋率為82.8%。包埋后水分活度大于0.35時,包被酶在干熱的情況下殘存酶活比原酶有較大的提高,殘存酶活提高8.7%,濕熱的情況下,殘存酶活提高58.3%。專利CN1981597A描述一種飼用耐高溫植酸酶的制備方法。先將植酸酶與輔料滑石粉和碳酸鈣混合,用黏合劑黃原膠溶

16、液制軟材,經(jīng)擠壓滾圓后干燥制成含酶微丸;再置于包衣鍋中使用羥丙基甲基纖維素和聚乙二醇水分散體進行包衣,制成包被型含酶顆粒,最后將包衣后的微丸置于3050干燥箱內(nèi)干燥38h。此法制得的包被型含酶顆粒可在85處理1min后酶活保留率超過85%。處方為植酸酶800g、羥丙基甲基纖維素10g、黃原膠 10g 、聚乙二醇30g 、滑石粉50g 和碳酸鈣50g 。專利CN1775067A 制備一種腸溶包膜顆粒植酸酶。工藝為將植酸酶粉、穩(wěn)定劑與黏合劑羥甲基纖維素混合,經(jīng)切割、整圓、50低溫干燥、噴霧成膜和再干燥制得包膜植酸酶顆粒。其中植酸酶粉、穩(wěn)定劑和腸溶膜材料的比例為85.8%90.4%、6.8%12.2

17、%和0.7%16%。穩(wěn)定劑的組分構(gòu)成為蔗糖75%、食鹽10%和蛋白質(zhì)15%。成膜材料由丙烯酸樹脂、蟲膠和羥乙基纖維素組成,是腸溶型脂溶性包衣材料,以乙醇溶解,質(zhì)量比為111。該包膜植酸酶顆粒在80溫度下保溫5min 后,酶活保留率超過85%。專利CN 101168734A 在植酸酶的發(fā)酵液中加入玉米淀粉、玉米芯粉、云石粉和乳糖(比例為30%50%、10%30%、5%15%和10%25%,經(jīng)搖擺制粒、拋圓和干燥制成含酶顆粒。再使用羥丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、聚丙烯酸樹脂和聚乙烯吡咯烷酮進行流化床包衣和干燥篩分,得到胃溶性包被植酸酶顆粒。所用包衣材料為胃溶性水溶性材料,以水溶解,不使用有機溶

18、劑。各包衣材料按10%30%10%30%30%50%10%30%比例形成。所得包被型植酸顆粒在制粒溫度達85時,仍能達到90%的酶活保留率。與普通植酸酶相比,在85條件下,制得的含酶顆粒與包被型植酸酶的酶活保留率分別提高24%和35%。3研究展望植酸酶作為單胃動物的飼料添加劑,應(yīng)用范圍廣泛,需求量大,而且它對提高畜禽的生產(chǎn)性能和健康水平、減少環(huán)境污染和保護生態(tài)環(huán)境有重要意義。植酸酶的研究在國際上已開展了幾十年,而對其熱穩(wěn)定性的研究起步較晚,還有待進一步深入。 在提高植酸酶熱穩(wěn)定性的方法中,與其他方法相比較,制劑學方法提高植酸酶熱穩(wěn)定性,包括在酶液中添加穩(wěn)定劑、選擇適合的載體制成普通顆粒、后噴涂酶液體及進行酶的包被處理等,一般不會改變植酸酶的理化性質(zhì),并且具有開發(fā)期短、成本低和耐熱效果顯著等優(yōu)勢。筆者認為:植酸酶熱穩(wěn)定性研究需要與植酸酶活性的檢測,儲存穩(wěn)定性,尤其是動物體內(nèi)應(yīng)用效果的評定研究相結(jié)合。此外,單純提高植酸酶的耐熱性是遠遠不夠的,同時具有耐熱性高、最適pH 和蛋白酶抗性低等綜合性能的植酸酶才是今后發(fā)展的關(guān)鍵所在。參考文獻1王琤韋華,翟明仁.植酸酶的研究進展及應(yīng)用.養(yǎng)殖與飼料,2005(6:13-16.2廖明星,顧振新.植酸酶基因工程及開發(fā)利用研究.食品科學,2003,24